副豬嗜血桿菌與Glässer氏病研究進展

副豬嗜血桿菌與Glässer氏病研究進展

宣華教授

（廣東省農科院獸醫研究所  　廣州五山 510640）

    目前，副豬嗜血桿菌感染已成為全球性的問題。在近幾年內，我國已從北京、黑龍江、遼寧、河南、湖南、寧夏、湖北等地區的一些豬群中分離出副豬嗜血桿菌。

    副豬嗜血桿菌感染可呈現多種臨床類型，典型經過的者稱作Glässer氏病（Glässer＇s Disease），以纖維素性多發性漿膜炎、多發性關節炎和腦膜炎為其臨床特征。有的無多發性漿膜炎變化但呈急性肺炎經過，也有呈急性敗血癥經過的。發病年齡從2周齡至4月齡，通常多見于5～8周齡的仔豬。衛生狀況良好的豬群，一旦遭遇到應激因素，往往更易爆發本病，感染過程往往也更為嚴重，發病率和病死率都會很高，如發病率可達到10%～15%，病死率可達到50%。副豬嗜血桿菌是上呼吸道的常在微生物，是一種機會致病菌，可以并發或繼發于藍耳病、偽狂犬病、細小病毒病、圓環病毒病、豬瘟等疫病，使疫情復雜化，經濟損失加重。副豬嗜血桿菌感染與豬胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌等病原體一起已經共同成為當今現代化集約豬場新的麻煩問題之一。

1 副豬嗜血桿菌

    Glässer（1910）首次報道，他在患有漿液性纖維素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關節炎和腦膜炎的病豬的滲出液中發現了這種革蘭氏陰性細菌，但分離培養成功的人可能是Schermer 和Ehrlich（1922）。

    在研究早期，曾把需要Ⅹ（鐵卟啉）和Ⅴ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD）兩種生長因子的豬嗜血桿菌（Haemophilus suis） 視為Glässer氏病的致病菌。后來，Biberstein和White（1969）證明來自Glässer氏病的病原菌只需要NAD。因此，他們提議把不需要補給X因子的嗜血桿菌在命名時加前綴“para（副）”以示區別，從而提出一個新種——副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）。

1.1形態

    副豬嗜血桿菌是巴氏桿菌科嗜血桿菌屬中一種小桿菌。革蘭氏陰性，不能運動，帶莢膜的菌株一般呈球桿狀，無莢膜的菌株形態多樣，呈桿形或絲狀。經熱抽提、電泳分離和十六烷三甲基溴化氨（Cetavalone）沉淀后發現，莢膜中含有多種多糖物質（Morozumi和Nicolet，1986）。在雞胚絨毛尿囊膜上生長時，本菌還可形成絲狀形態，并產生菌毛樣結構(Munch 等,1992)。

1.2培養和生化特征

    本菌的生長需要使用含有Ⅴ生長因子的培養基如巧克力瓊脂、Levinthal瓊脂、加NAD的PPLO瓊脂等。在血液瓊脂上本菌在金黃色葡萄菌菌苔周邊呈衛星狀生長，不產生吲哚，發酵葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和麥芽糖。

    當從豬呼吸道分離細菌時，可能會分離到其他不溶血、脲酶陰性、依賴NAD的類似細菌。過去，把這類細菌用嗜血桿菌“小群（minorgroup）”一詞來統納，并有C、D、E、F之別。如果進行深入詳細的生化分析，即可將它們與副豬嗜血桿菌區分開。D、E、F群為上呼吸道中常在的菌群，但也可以從肺或腦組織中分離到。Moller等人（1993）在DNA同源性分析的基礎上指出，D和E群屬于同一種，故將這兩個群合并。隨著研究的深入，Moller等（1996）提出了三個新種，對應于“minor group”、D+E群和F 群，這3個新種分別是小放線桿菌（Actinobacillus minor），豬放線桿菌（A.porcinus）和吲哚放線桿菌（A.indolicus）。對所有來自呼吸道的V因子依賴的細菌進行16SrRNA序列比較分析后發現，副豬嗜血桿菌與吲哚放線桿菌（F群）關系最為密切，同源性達到97.4%到97.7%。兩者的差別是，吲哚放線桿菌可以產生吲哚和發酵棉子糖。

1.3血清型

    血清分型研究結果表明，副豬嗜血桿菌各菌株的抗原性具有高度異源性。Bakos等（1952）依據沉淀試驗的結果報告存在A、B、C、D四個血清型，之后，Morozumi和Nicolet報告了7個血清型（1～7），Kiestein等(1991)又增加了6個（Jena6～Jena12）。Kielstein和Rapp－Gabrielson（1992）又鑒定了5個新血清型（ND1～ND5）。為了使血清分型得到統一， Kiestein和Rapp－Gabrielson（1992）根據用特異性兔抗血清進行的免疫擴散試驗結果，提出了豬副嗜血桿菌新的血清型分類體系，即保留過去已證實的血清型1～7，血清型Jena和ND合并為血清型8～15。目前，這一分型方法已被各國采納，并明確副豬嗜血桿菌現有15個血清型（1～15）。值得一提的是，盡管如此，還是有大量的分離株不能被分型。

    許多國家研究了本菌血清型的分布情況。在日本、法國、美國、西班牙、加拿大和中國，以血清4型為優勢型，血清5型也經常分離到(Morikoshi等，1990；Kielstein和Rapp-Gabrielson，1992；Rubies等，1999；；Tadjine等，2004；Cai等，2005)。澳大利亞和丹麥流行的是血清5和13型（Blackall等，1996, 1997；Rafiee和Blackall，2000；Angen，2004）。

1.4 毒力和毒力因子

    副豬嗜血桿菌的毒力因子迄今尚未搞清。血清學分型通常要考慮到與毒力的關系。用血清5、10、12、13和14型菌株經腹腔途徑感染SPF豬，其發病和病死高峰集中在4d之內，因此認為，它們強毒血清型；血清2、4和15型引起多發性漿膜炎，無死亡，為中毒力型；剩下的血清型（3、6、7、8、9和11）不引起任何臨床癥狀，為無毒血清型（Kielstein and Rapp-Gabrielson, 1992；Amano 等,1994）。從病豬呼吸道和其它部位分離到菌株，血清型別相似，有血清2、4、5、12、13和14等型。北美地區血清型流行狀態的調查結果表明，呼吸道以外部位分離到的菌株，血清型主要是1、2、4、5、12、13和14，以及許多還不能分型的。來自健康豬上呼吸道的，主要是血清3型和不能分型的。

    眾所周知，巴氏桿菌科成員具有一些非常重要的毒力因子如莢膜、菌毛、脂多糖（LPS）、外膜蛋白(OMP)等。但是，副豬嗜血桿菌是否就產生這些毒力因子，以及它們與本菌的毒力是否有關，目前還知之甚少，彼此矛盾之處頗多。

    有人運用人工感染試驗研究了莢膜與毒力的關系。據Little和Harding（1971）以及Morozumi和Nicolet（1986）報道，從健康豬鼻腔和病豬病料中獲得的菌株，帶莢膜的并不多。

    Munch等（1992）證明，副豬嗜血桿菌在體內傳代后能夠生成菌毛樣結構，但其致病作用不清楚。

    LPS可能是一個重要的毒力因子。但是，Zucker等（1996）又未發現強毒株的LPS與無毒株的LPS有明顯的差異。同樣，Miniats等（1991）發現，用含有LPS和OMP抗原的菌苗免疫動物，僅是有OMP抗體的豬才能抵抗強毒菌的攻擊。這些事實似乎表明，LPS不是副嗜血桿菌的主要毒力因子。之后，Amano等（1997）進一步研究了LPS的致病作用，他用血清5型菌株接種動物后發現，血流中LPS抗體的出現與血栓形成和彌漫性血管內凝血有關。現已清楚，副豬嗜血桿菌的LPS具有與其它革蘭氏陰性細菌內毒素相似的活性（Raetz和Whitfield，2002）。

    應用SDS-PAGE技術發現，副豬嗜血桿菌的外膜蛋白(OMP)具有2個完全不同的生物型：生物1型和生物2型。由健康豬鼻粘膜分離到的菌株表達生物1型OMP，其分子量一為約68Kda，另一在23～40KDa之間。由Glässer氏病病豬分離到的菌株通常含生物2型OMP，其以約37KDa的優勢蛋白為特征。后來，Oliveira和Pijoan（2004）通過全菌蛋白組分計算機分析證實了這些發現。

    副豬嗜血桿菌的另一個毒力因子可能是神經氨酸酶。Lichtensteiger和Vimr（1997）發現，90％以上野毒株產生神經氨酸酶。該酶在本菌的對數生長期末期開始表達。神經氨酸酶的作用是通過酶解而暴露為本菌定植和侵入宿主細胞所必需的受體。宿主的防御系統也可因降低粘蛋白黏性而遭到破壞。

    與毒力有關的毒素，至今尚未發現。Schaller等（2000）也排除了副豬嗜血桿菌具有產生與胸膜肺炎放線桿菌RTX（Apx）毒素相關的毒素的基因。

    Blackall等（1997）運用多座位酶電泳（multilocus enzyme electrophoresis，MEE）技術試圖分析呼吸道以外分離株與呼吸道分離株之間的區別。結果是，他們不僅揭示了不同來源菌株間的巨大不同點，而且發現了同一血清型不同菌株間的巨大差別，研究人員把它們分為2個MEE主群，但是，也沒有發現菌株分離部位與MEE群之間的關系。

    Hill等（2003）運用差異RT-PCR技術(differential display RT-PCR)研究了菌株1185（血清5型）的毒力。該菌在與急性病例相似的40℃高溫條件下生長后，作者發現有7個基因在表達，它們分別與fadD（脂肪酰基輔酶A合成酶）、apaH（二腺苷四磷酸）、pstI（磷酸轉移酶體系酶Ⅰ）、cysK（半胱氨酸合成酶）、StD（Na＋和Cl-依賴離子轉運蛋白）、HSPG（哺乳動物基底膜特異的肝素硫化物核芯蛋白前體）和PntB（吡啶核苷轉氫酶）基因同源。15個血清型都有相同的表達。它們與毒力因子的關系尚在研究中。

1.5 分子生物學分型

    基因分型的方法已被用于副豬嗜血桿菌菌株的分類。此類方法與血清分型法比較，特征比較明顯。通過鑒定菌株DNA圖譜后發現，某些DNA圖譜可能與毒力有關聯，如由全身感染分離到的菌株與非致病性菌株截然不同，前者各菌株間同源性相當高（Oliveira等2003）。

    Smart等（1988）應用限制性內切酶指紋圖譜法（REE）研究了SPF豬群和常規豬群副豬嗜血桿菌的分布情況，在絕大部分SPF豬群，都可以發現相似圖譜的菌株，而常規豬群菌株的圖譜十分復雜。發病場病豬體分離到的菌株，其圖譜亦相似，但與同一豬群由健康豬鼻腔分離到的菌株圖譜不同。

    基于重復元件的PCR（repetitive element based－PCR，rep-PCR）技術也被用于副豬嗜血桿菌的基因分型。該法先通過ERIC（enterobacterial repetitive intergenic consensus）引物擴增大小不同的DNA片段，再經電泳分離來揭示特異基因組圖譜。用這種方法進行分析，即使是相同血清型的菌株也可分辨出不同的DNA圖譜。研究發現，能致死病豬的菌株并不多，但它們都具有相似的DNA圖譜（Versalovic等,1991,1994；Woods等1993；Rafiee等,2000；Oliveira等,2003）。

    進行副豬嗜血桿菌基因分型的另一種方法是PCR限制性酶切電泳長度多態性試驗（PCR－restriction fragment length polymorphism ，RELP）。運用這種方法分析tbpA（一種編碼運鐵蛋白結合蛋白的基因），從15個血清型的標準菌株分出了12個不同的DNA圖譜，其中血清5、12、14和15型標準菌株的限制性多態圖譜相同。在鑒定101個野毒株時，發現了33個RELP圖譜，其中有10個與標準菌株的相同。未發現血清型和RELP譜型間的相關性（Redondo等，2003)

2  發病機理

    副豬嗜血桿菌最初的定植部位是否就是上呼吸道，迄今尚無定論。Vahle等（1995）經鼻感染5周齡CDCD仔豬，發現接種后36h可從血液、鼻腔和氣管內分離到接種物，在肺和血液涂片中不易發現病菌，也沒有從扁桃體中分離到。Amano等（1994）用血清1、4和5型菌株經鼻接種于豬后，則從鼻腔和扁桃體中分離到副豬嗜血桿菌。Segales等（1997）報道在氣管內接種后，常可從扁桃體和氣管拭子中分離到接種物。2001年Kirkwood等則報道了從染豬鼻腔拭子中分離到副豬嗜血桿菌的結果。

    造成副豬嗜血桿菌侵及全身的因子，尚未被大家公認。Vahle等（1997）證明，能從鼻腔中段分離到副豬嗜血桿菌的豬常伴有急性化膿性鼻炎和黏液纖毛細胞（mucocilliary cell）消失。作者還提出，這些粘膜的改變有助于副豬嗜血桿菌的侵入以及到達血流。但是，無論是通過電鏡還是通過免疫組化方法，均未能在纖毛消失和粘膜細胞變性的部位找到副豬嗜血桿菌。

    Brockmeier（2004）證明，支氣管敗血波氏桿菌（B.bronchiseptica）是造成副豬嗜血桿菌在上呼吸道定植的誘因，其情形與豬萎縮性鼻炎中多殺性巴氏桿菌的作用相似。

3  流行病學

    副豬嗜血桿菌感染呈地方性流行。主要通過直接接觸傳播。多是因從感染性豬群引進帶菌豬而帶進致病性菌株。各年齡豬均易感染，都可爆發本病。同樣，一旦抗原性不同的新的強毒菌株侵入豬群，也可以引起疫病爆發（Oliveira和Pijoan，2002）。

    在感染性豬群中，母豬是病菌的儲主，無論是致病性還是非致病性菌株，仔豬都是在哺乳期被感染的。但是事實上，母豬的帶菌率并不高，因此被感染的仔豬也只是一小部分。被感染的小豬可因感染而產生免疫力，但以后也可能成為亞臨床帶菌豬。未被致病性菌株感染的仔豬，可從母源抗體獲得保護。到5~6周齡斷奶時，母源抗體水平下降，可因斷奶因素的影響而致使亞臨床帶菌豬數量增加，那些在哺乳期沒有接觸過致病性菌株的豬只開始發病。因此，本病的臨床癥狀通常在5~6周齡時即斷奶之后出現。