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總糖和還原糖的測定（二）
──3,5－二硝基水楊酸法
目的要求：
掌握還原糖和總糖的測定原理，學習用比色法測定還原糖的方法。
實驗原理:
在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內，還原糖的量與光吸收值呈線性關系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。
黃色 桔紅色
試劑和器材
一、試劑
3,5－二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取6.5g DNS溶于少量熱蒸餾水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氫氧化鈉溶液325ml，再加入45g丙三醇，搖勻，冷卻后定容至1000ml。
葡萄糖標準溶液：準確稱取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至100ml，即含葡萄糖為2.0mg/ml。
6mol/L HCl：取250ml濃HCl（35%～38%）用蒸餾水稀釋到500ml。
碘－碘化鉀溶液：稱取5g碘，10g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中。
6N NaOH：稱取120g NaOH溶于500ml蒸餾水中。
0.1% 酚酞指示劑。
二、材料
藕粉，小麥淀粉或玉米淀粉。
三、器材
723PC、S22型分光光度計，天平，水浴鍋，電爐，試管若干等。
一、葡萄糖標準曲線制作
取5支15mm×180mm試管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖標準液和蒸餾水。
管號 葡萄糖標準液 蒸餾水 葡萄糖含量 OD540
/ml /ml /mg
0
1 0
0.2 1
0.8 0
0.4
2 0.4 0.6 0.8
3 0.6 0.4 1.2
4 0.8 0.2 1.6
5 1 0 2
操作方法
在上述試管中分別加入DNS試劑2.0ml，于沸水浴中加熱2min進行顯色，取出后用流動水迅速冷卻，各加入蒸餾水9.0ml，搖勻，在540nm波長處測定光吸收值。以1.0ml蒸餾水代替葡萄糖標準液按同樣顯色操作為空白調零點。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。
二、樣品中還原糖的提取
準確稱取 0.5g小麥（）粉，放在100ml燒杯中，先以少量蒸餾水(約2 ml)調成糊狀，然后加入40ml蒸餾水，混勻，于50℃ 恒溫水浴中保溫20min，不時攪拌，使還原糖浸出混。過濾，將濾液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即為還原糖提取液。
三、樣品總糖的水解及提取
準確稱取0.5g小麥(玉米)淀粉，放在錐形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸餾水15ml，在沸水浴中加熱0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈現藍色。水解畢，冷卻至室溫后加入1滴酚酞指示劑，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到100ml，過濾取濾液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍的總糖水解液，用于總糖測定。
四、樣品中含糖量的測定
取7支15mm×180mm試管，分別按下表加入試劑：
項目 空白 還原糖 總糖
H2O/ml 1 0 0 0 0
樣品溶液/ml 0 1 1 1 1
3,5-二硝基水楊酸試劑/ml 2 2 2 2 2
OD值/540nm
加完試劑后，于沸水浴中加熱2min進行顯色，取出后用流動水迅速冷卻，各加入蒸餾水9.0ml，搖勻，在540nm波長處測定光吸收值。測定后，取樣品的光吸收平均值在標準曲線上查出相應的糖量。
五、結果處理
按下式計算出樣品中還原糖和總糖的百分含量：
式中：C──還原糖或總糖提取液的濃度，mg/ml；
V──還原糖或總糖提取液的總體積，ml；
m──樣品重量，g；
1000──mg換算成g的系數。 |
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狗仔卡
發表于 2008-8-1 15:25:19
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