生物化學

lzm_001 · 發表于 2006-2-25 22:46:38

現代動物生物化學
第一講蛋白質化學
一、蛋白質的一級結構
（一）、蛋白質的構件分子
20種氨基酸都屬于α-氨基酸，按側鏈的極性和有無電荷分為非極性側連氨基酸、不帶電荷的極性側連氨基酸、帶電荷的極性側連氨基酸。含特異遺傳密碼，也稱編碼氨基酸。
非編碼氨基酸是在蛋白質合成后或合成過程中由相應的氨基酸殘基經修飾而成的。
（二）、肽鍵與肽鏈
蛋白質是由構件分子氨基酸通過肽鍵連接而成的多聚生物大分子多肽。
肽鍵 —CO—NH— （酰胺鍵）
水解肽鍵的酶有內肽酶和外肽酶兩類，內肽酶對氨基酸的種類有選擇性；而外肽酶對氨基酸的種類無選擇性。
10個以下的肽稱寡肽，10個以上的肽稱多肽。一條多肽鏈有一個C末端和一個N末端。
二硫鍵是蛋白質結構中常見的一種共價鍵。
多肽與蛋白質的區分通常以50-100個氨基酸為界，但并非絕對。
（三）、蛋白質一級結構的內容——測定方法與原理
蛋白質一級結構的測定是蛋白質高級結構和酶活性部位研究的前提。
一級結構測定的基本戰略是用兩套斷鏈方法分別將純化的蛋白質肽鏈裂解成肽段，再將各個肽段分離純化，并測定每個肽段的順序，然后比較兩套肽段氨基酸順序以排定蛋白質一級結構。
一級結構測定前的準備
1）蛋白質的純化純度必須達到98%以上。
蛋白質常用的純化方法有SDS-PAGE，高效液相層析（HPLC）。純度的鑒定常用電泳和層析法
2）、蛋白質分子量的測定
常用凝膠過濾、SDS-PAGE、超速離心、毛細管電泳、質譜等。
3）、蛋白質多肽鏈數目和大小的測定
用還原性SDS-PAGE分析，若分子量變小，則說明此蛋白質由2條以上多肽鏈組成，然后將每條多肽鏈分離出來，分別測定其一級結構。
4）、封閉自由巰基
游離的巰基必須封閉，否則在純化肽段時易氧化為多種產物。常用碘代乙酸烷化法。
5）、去除N末端封閉的基團
N-末端有時會被封閉，應用相應的方法除去N-末端封閉基團。
氨基酸組成的測定
1）、蛋白質的水解
將蛋白質水解成游離的氨基酸，水解的方法有酸水解、堿水解和酶水解。常用的是酶水解。
酸水解色氨酸全部破壞，應添加巰基乙醇作保護劑。
2）、氨基酸的組成
經典的氨基酸組成分析法是茚三酮法。用自動氨基酸分析儀經離子交換層析相繼分離，各種氨基酸與茚三酮反應形成紫色化合物，然后在570nm及440nm波長測定光吸收，計算出氨基酸的含量。
3．鏈的拆離與純化
由幾條肽鏈組成的蛋白質，須將不同的蛋白質肽鏈拆開，并分離純化。
1）、二硫鍵的拆開
氧化法：過甲酸
還原法：巰基乙醇、巰基乙酸等
2）、共價鍵的拆開
I）、改變pH值：蛋白質解離的臨界pH值為3-4、9-10。
II）、強變性劑：尿素和鹽酸胍與巰基乙醇共用。
3）、肽鏈的分離純化
4．末端氨基酸的測定
測定末端氨基酸可確定蛋白質分子中多肽鏈的數目。
1）、N-末端的測定
常用2、4-二硝基氟苯（DNFB）法、二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）法、異硫氰酸苯酯（PTH）法等。
2）、C-末端的測定
常用的方法有：肼解法、羧肽酶法、還原氨基醇法等。
5．肽鏈的專一性裂解與肽段的分離純化
1）、肽鏈的專一性裂解
化學裂解法：專一性化學試劑：溴化氰裂解法；酸水解；堿水解
酶水解法：胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶等，每一種酶都有一個專一的切點。
2）肽段的分離純化
可用層析和電泳的方法分離提純。
6．肽段氨基酸排列順序的測定
常用化學法：Edman降解法；蛋白質序列測定儀可自動檢測氨基酸的性質、含量和氨基酸序列。
7．蛋白質一級結構的建立
氨基酸排列順序測定出來以后，將小肽段重新構成大肽段或蛋白質的一級結構。
肽段重疊：將斷裂的許多肽段的氨基酸按順序排列，最后用重疊的方法確定整個多肽或蛋白質的氨基酸排列順序。
原則：將一段一段小肽按一定順序排列，將各個樣品中相同的氨基酸殘基位置對準重疊排列。
二硫鍵位置的確定：將完整的蛋白質分子不經任何處理，直接用酶或酸水解，用凝膠過濾或離子交換層析等方法及二硫鍵鑒定的顯色反應，分離檢出其中含有二硫鍵的肽段，將肽的二硫鍵拆開，分別測定兩個肽段的順序，將兩個肽的結構與已測定的蛋白質一級結構進行比較，找出相應的二硫鍵位置。
A-1 AF
A-2 AFGR
B-1 GRLY
B-2 LYKW
A-3 KW
B-3 WHS
A-4 HS

AFGRLYKWHS
二、蛋白質一級結構與功能的關系
同源蛋白質一級結構差異與分子進化
同源蛋白質：在不同生物種屬中執行同一功能的蛋白質。
不同生物體的同源蛋白質一級結構在氨基酸組成和順序上不同，存在種屬差異。同源蛋白質一級結構的差異可反映種屬間的親緣關系，但不影響其生物學功能。
1．胰島素
不同種屬哺乳動物胰島素的功能相同，但其一級結構不同。胰島素由A、B兩條鏈組成，不同種屬動物A鏈第8、9、10三個氨基酸殘基和B鏈C-末端第30個氨基酸殘基有差別，這4個氨基酸殘基對胰島素的生物活性不起決定性作用。胰島素結構中有20個氨基酸保持不變，是胰島素生物活性所必需的。
2．細胞色素C
帶有一個血紅素輔基的一條多肽鏈。不同動物細胞色素C氨基酸除了不變的殘基外，還有相當一部分是不同的，不同動物間差異有所不同，有些差異很小，有些差異很大。
在細胞色素C不變的氨基酸殘基中，有些位置的殘基對所有生物都是不變的，這些殘基稱保守殘基。
3．肌紅蛋白
由一個血紅素輔基和一條153個氨基酸殘基的多肽鏈組成。不同動物肌紅蛋白的氨基酸組成和排列順序相似，但不同。
4．血紅蛋白
由珠蛋白和亞鐵血紅素組成。不同動物血紅蛋白α-鏈和β-鏈結構不同，但有些有高度的相似性，如人與抹香鯨。
5．α-乳清蛋白和溶菌酶
α-乳清蛋白由123個氨基酸組成，溶菌酶由129個氨基酸組成，兩者多肽鏈的數目、氨基酸數目、鏈內二硫鍵的位置和數目相似，為同源蛋白質，但兩者的功能不同。
（二）蛋白質一級結構差異與分子病
同種生物來源的一種蛋白質，有時存在兩種或兩種以上形式，它們的氨基酸序列差異很細微，通常只有一二個氨基酸殘基的差別。這種細微的差別在某些情況下可引起功能的明顯變化，有時甚至引發疾病，如分子病。
分子病是由構成生物體基本物質分子一級結構發生變異而引起的疾病，這種變異來源于基因的突變。
基因突變的類型：
誤義突變：由于堿基突變使某一氨基酸的密碼子變成另一氨基酸的密碼子。
無義突變：基因中某一氨基酸密碼子變為終止密碼子，使多肽鏈合成提前終止。
移碼突變：基因中堿基缺失或插入，造成這一位置以后一系列或部分編碼發生移位錯誤。
血紅蛋白基因突變可導致血紅蛋白一級結構改變而產生異常血紅蛋白，引起血紅蛋白病。如鐮刀狀貧血病，β-鏈N-末端第6位谷氨酸被纈氨酸取代，使紅細胞的形狀變成鐮刀型而引起溶血。
（三）活性肽一級結構與功能
活性肽是一類分子量小于6000，構象松散，具有多種生物功能的小肽，其主要功能是傳遞信息，調節代謝和協調器官功能。
包括多肽激素、組織激肽、神經肽等，其一級結構的改變可使活性升高、降低或消失。
根據這一特點，可對其結構進行改造或人工合成。

三、蛋白質分子構象
蛋白質分子構象又稱高級結構或空間結構指蛋白質分子中所有原子在三維空間的分布。
為研究方便將蛋白的結構劃分為不同的層次，分為一級結構和空間結構，空間結構又分為二級結構、超二級結構、結構域、三級結構和四級結構。
主鏈構象
1．α-螺旋
（1）多肽鏈以α-碳原子為轉折點，以肽鏈平面為單位，通過兩側結合鍵的旋轉，形成穩定的右手螺旋；
（2）每圈螺旋有3.6個氨基酸殘基，螺距為0.54nm，每個氨基酸殘基圍繞螺旋中心軸旋轉100o，上升0.15nm；
（3）相鄰兩個螺旋之間形成鏈內氫鍵，其方向與螺旋軸平行，氫鍵由第1個氨基酸殘基N原子上的H與其后第4個氨基酸殘基羰基的O原子之間形成。
（4）各氨基酸殘基測鏈R基團均伸向螺旋外側；
（5）α-螺旋有左手和右手兩種，天然蛋白質絕大多數為右手螺旋。
2．β-折疊
存在于大量絲蛋白和β-角蛋白中。
有兩條或多條伸展的肽鏈借助鏈間氫鍵形成的折疊片層結構，氫鍵與鏈垂直，-碳原子處于折疊角上，側鏈交替出現在片層結構的上下方，并與片層垂直。
有順式平行、反式平行或順反平行交替。
3．β-轉角
多肽鏈180o回折形成的特殊結構，由4個氨基酸殘基組成，第1和第4之間形成氫鍵。
4．發夾結構
伸展的多肽鏈彎曲、彼此靠近并呈反向平行的發夾狀結構。
5．Ω環
由6-16個氨基酸殘基卷曲形成的Ω型結構。
6．無規則卷曲
主鏈形成沒有規則的卷曲。
7．三股螺旋
由三條左手螺旋的多肽鏈相互纏繞形成右手三股螺旋。
側鏈構象
1. 疏水區
多肽鏈中具有非極性側鏈的氨基酸，其側鏈有疏水趨勢，當許多這類非極性側鏈聚集在蛋白質分子內部時變形成疏水區。
許多球蛋白分子中都存在這種疏水區，與蛋白質的功能有關，如與配基的結合。
2．親水區
氨基酸的極性側鏈趨向于分布在球蛋白分子的表面，形成一個親水區，有助于穩定球蛋白的構象并增加蛋白質的水溶性。與蛋白質的功能有關，如酶的活性中心。
二級結構
指多肽鏈主鏈骨架全部或部分按一定規律排列形成的空間結構，不涉及側鏈構象，如α-螺旋、β-折疊、β-轉角等。
二級結構的類型主要是α-螺旋，其次是β-折疊，在不同的蛋白質中這兩種結構所占的比例不同，多數蛋白質具有α-螺旋、β-折疊的混合結構。
超二級結構和結構域
1．超二級結構
蛋白中存在由若干相鄰的二級結構單元按一定規律組合在一起，形成在空間上可彼此區別的結構單位，稱超二級結構。主要涉及α-螺旋和β-折疊在空間的組合、排布。
（1）αα：由兩股或三股右手α-螺旋纏繞形成的一種緊密的左手超螺旋。
（2）β×β：由兩段平行的β-折疊鏈借助一段連接鏈組成，連接鏈可以是無規則卷曲或α-螺旋。最常見的組合包含3段平行β-折疊和2段α-螺旋。
（3）βββ：由反向平行的β-折疊組成的超二級結構，主要包括β-迂回和回型拓撲結構。β-迂回中的β-折疊鏈通過緊湊的β-轉角連接，回型拓撲結構中的β-折疊是通過一般的肽鏈越過反平行β-折疊形成的圓筒結構相連。
2．結構域
在蛋白質結構中，一條多肽鏈上常存在一些緊密的、相對獨立的區域，稱結構域。
結構域是蛋白質結構的功能單位和折疊單位，是在二級結構和超二級結構基礎上形成的特定區域，參與蛋白質結構的裝配，并與蛋白質的許多功能有密切關系。
蛋白種結構域的數目不等，一種蛋白質分子中的幾個結構域，有的十分相似，有的完全不同。
蛋白質中結構域之間的連接不盡相同，彼此獨立的球狀結構域之間可借柔性肽鏈松散連接，有些結構域之間接觸緊密而又廣泛，每個結構域所具有的表面就是肽鏈構象外表面的一部分。
結構域的類型：
（1）α-螺旋域：主要是α-螺旋，由4個接近等長的α-螺旋依次與其鄰近的螺旋相連形成的近四方體結構。
（2）β-折疊域：由反平行的β-折疊構成。常見的是由回型拓撲結構形成的圓筒構象。
（3）α+β域：由α-螺旋和β-折疊不規則堆積形成的。
（4）α/β域：α-螺旋和β-折疊和交替出現。
（5）無αβ域：結構域中不含α-螺旋和β-折疊。
結構域對蛋白質構象和功能的意義：
（1）多肽鏈先分別折疊成幾個結構域，再進一步形成完整的構象，比直接折疊成天然構象在動力學上更合理。
（2）結構域之間通過共價鍵連接，可僅借助一條或少數幾條柔性的肽鏈而連接，在結構上具有可運動性。
（3）結構域之間連接的相對靈活性有利于蛋白質空間構象的運動性，可直接或間接地參與蛋白質的多種功能，如分子識別和相互作用等。
（4）結構域是蛋白質的結構和功能單位，不同結構域有不同的功能，可完成底物結合、催化反應、亞基間的相互作用及調節活性等多種功能。
（5）結構域可作為重要折疊單位，在新生肽鏈形成特定空間結構的過程中起重要作用。
（五）蛋白質分子的三級結構
具有特定氨基酸序列的多肽鏈，在形成空間構象時，先由相鄰的氨基酸殘基形成一些有規則的結構單元，并由相鄰的的二級結構聚集形成超二級結構，進而折疊成一些相對獨立的結構域，最后構建成完整的、具有生物活性的構象，這種構象稱蛋白質的三級結構。
1．球狀蛋白質的結構的特征
（1）多肽鏈借助各種結構單元、超二級結構等折疊成緊密的球狀構象，構象中的螺旋以右手α-螺旋為主，肽鏈轉折處為β-轉角，有較多的無規則卷曲連接各種結構單元。
（2）非極性側鏈位于分子內部的疏水區，極性側鏈位于分子表面形成親水區。
（3）分子表面由內陷的疏水空穴，是蛋白質進行識別和結合的關鍵部位，參與蛋白質的多種功能。
（4）同類球蛋白具有基本相同的三級結構，不同種類球蛋白具有完全不同的三級結構。
（5）球蛋白分子結構既具有專一性，又具有靈活性，二者的高度協調統一是球蛋白功能的多樣性和復雜性的結構基礎。
2．肽的構象
分子量較大的多肽構象與蛋白質接近，由于主鏈和側鏈相互作用和制約較少，其構象不如蛋白質穩定，具有很大的靈活性，有助于其參與體內多種功能的調節。
（六）蛋白質分子的四級結構
亞基：分子量較大的球蛋白分子由兩條或多條多肽鏈通過非共價鍵連接形成，其中每條肽鏈都有獨立的三級結構，稱為亞基。
四級結構：各亞基間相互作用并組裝成有生物活性的特定構象稱四級結構。
單體：蛋白質聚合物中的一個蛋白分子。
亞基必須通過非共價鍵組裝成完整的具有四級結構的蛋白質才具有生物活性，寡聚蛋白可由相同或不同的亞基組裝，如不同亞基組裝的蛋白質分子可出現多種亞基結合形式，如乳酸脫氫酶。
四、蛋白質構象與功能的關系
一）、分子識別
是指蛋白質與蛋白質、核酸、脂等分子之間特異的辨認。對機體完成許多過程至關重要，如抗原—抗體、酶—底物的特異結合、基因表達調控等。
蛋白質分子識別的機制
以往的概念認為，抗原—抗體、酶—底物、激素—受體等蛋白復合物的形成中是相互作用的兩個分子之間整個互補界面的相互作用，涉及整體空間構象的識別與契合。
近年來的研究認為，結合的兩個分子之間的相互作用來自少數幾個關鍵基團之間的次級鍵，用含有這幾個關鍵基團的線形肽可模擬相應完整蛋白質的作用。這表明蛋白質生物大分子之間的相互作用可能主要局限在幾個關鍵基團的相互作用。通過研究小肽片段的特異性相互作用，可能會揭示蛋白質分子識別乃至復雜的超分子體系的自我組裝等問題，并為小肽分子藥物和疫苗的設計提供依據。
小肽片段與生物大分子之間的識別，并不意味著含有這種小肽片段的蛋白質就可以與相應的大分子結合，只有具有一定構象的小肽序列才可與大分子結合。提示在蛋白質分子識別和相互作用過程中，識別區域的構象也起著關鍵作用。
2．蛋白質與核酸的識別
1）、調控蛋白的結構域
蛋白質與核酸的識別和相互作用是基因表達的關鍵環節。真核生物轉錄調控蛋白與DNA識別和結合的模式有多種類型，主要決定于調控蛋白的 DNA結合結構域的不同。
I、螺旋—轉折—螺旋
兩段螺旋被一段β-轉角分開，其中一段辨認螺旋，直接與暴露在DNA大溝中的堿基對接觸結合。辨認和結合的作用力包括氫鍵、離子鍵、范德華力。這種結構主要以二聚體形式與DNA結合。
在真核細胞的轉錄調控蛋白中幼兒還存在同源（異型）結構域，主要以單體形式通過螺旋—轉角—螺旋與DNA進行多位點結合，以保證識別的特異性。
II、鋅指結構
一個Zn++與4個Cys或2個Cys、2個His靠配位鍵結合，有一個疏水核心和極性表面，并有象手指一樣伸出的肽段，其數目為一個或多個。
鋅簇結構：存在于真菌轉錄因子中，在其DNA結合區有60個左右的氨基酸殘基，由6個Cys與2個Zn++形成鋅簇的核心。
鋅扭結構：存在于高等動物細胞內類固醇激素受體家族、受體蛋白與DNA相結合的區域，該區域約含150個氨基酸殘基，直接與DNA結合的有40-60個氨基酸殘基，其中有8個Cys與2個Zn++通過配位鍵形成2個四面體結構，有15個殘基將2個Zn++隔開，形成扭形的DNA結合位點。
III、亮氨酸拉鏈
是α-螺旋中一段富含有規律出現的亮氨酸殘基的片段，能形成2個α-螺旋，即螺旋的一側是以帶電荷的氨基酸殘基為主，具有親水性；另一側是排列成行的亮氨酸，具有疏水性，稱亮氨酸拉鏈。
具有亮氨酸拉鏈的蛋白質都以二聚體的形式與DNA結合。
IV、螺旋—環—螺旋
2個α-螺旋的中間被一段非螺旋的環分隔。與DNA結合性質與亮氨酸拉鏈相似，易形成二聚體。α-螺旋氨基端有堿性區，是結合DNA所必須是，螺旋區是形成二聚體所必須的。
2）、蛋白質與DNA識別機制
與DNA結合并調節基因轉錄的蛋白因子主要包括轉錄因子和轉錄調控因子。
蛋白因子與DNA識別的機制目前尚不完全清楚，但已獲得某些特點與規律：（1）、蛋白因子以二聚體的形式結合特異的DNA序列，異源二聚體的親和力大于同源二聚體。
（2）、蛋白因子的識別結構域與DNA的大溝或小溝識別位點結合。其中一個螺旋為專一性結合，另一個螺旋為非特異性結合。
（3）、識別螺旋有幾圈，其氨基酸殘基分為與DNA接觸的殘基、與DNA主鏈磷酸基團接觸的殘基和與蛋白其他部分接觸的殘基。這些特定殘基決定螺旋在DNA大溝內的傾斜狀態，對識別有重要作用。
（4）、DNA上的結合有幾個堿基對。蛋白質可誘導DNA構象發生變化有助于結合。
（5）、蛋白質—DNA間的相互作用主要為極性作用，同時也有疏水作用，識別的特異性主要來自氨基酸與堿基間的化學接觸。
（二）蛋白質的折疊
1．新生肽鏈折疊的特點
根據煙草花葉病毒外殼蛋白與核糖核酸在體外生理條件下能自組裝成感染活性的病毒這一現象，人們曾認為新生肽鏈在細胞內可在一級結構的基礎上，自動地折疊成天然構象，不需要其他分子或能量的支持，但近年來的研究發現了兩種幫助蛋白折疊的輔助蛋白和酶，因而現在的觀點認為：細胞內新生肽鏈的折疊是需要幫助的。
I、折疊啟動：有三種假說
疏水塌縮啟動折疊：肽鏈中的疏水作用力可導致肽段中形成疏水簇，再進入折疊中間狀態。
二級結構生成啟動折疊：小肽在水溶液中可形成穩定的二級結構，在蛋白質中可作為折疊的起始點。
特殊作用力啟動折疊：對蛋白質空間結構穩定有重要作用的化學鍵的形成可啟動蛋白質折疊。
II、中間狀態
目前已發現多種折疊中間狀態，如與二硫鍵有關的中間態、脯氨基順反異構中間態及熔球態等。其中熔球態是蛋白質折疊中最主要的一類折疊中間態。
III、折疊途徑
有人認為是能量優化的單一折疊途徑；有人認為是涉及復雜動力學過程的多折疊途徑。
2．分子伴侶
是一類相互之間沒有關系的蛋白質，其功能是幫助含多肽鏈的其他結構組分在體內以非共價鍵組裝，且不存在于組裝后發揮功能的結構中。
目前已確認的分子伴侶分為三個蛋白家族：伴侶素60家族、應激蛋白70家族和應激蛋白90家族。
分子伴侶與新生肽鏈識別、結合及解離以完成新生肽鏈折疊的機制目前尚不清楚。
3．幫助新生肽鏈折疊的酶
目前已確定的有兩種：蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）、肽酰脯氨酸順反異構酶（PPI）。
4．蛋白質折疊在跨膜轉運中的作用
蛋白質合成之后需要運送到細胞的各部分，這一過程需要經歷跨膜轉運。在轉運之前蛋白質必須處于解折疊狀態，轉運之后在進行折疊。這種解折疊與再折疊過程中可有分子伴侶參與。
5．蛋白質的折疊模式
許多問題尚不清楚，如一級結構同源，空間構象存在相似性；一級結構不同源，空間構象存在相似性（功能相似或功能不相似）。
6．蛋白質折疊家族
根據蛋白質氨基酸順序和功能的相似性，把某些蛋白質劃分為家族。一個蛋白家族一般屬于同源蛋白質，在進化上有一定聯系，在空間結構上有相似的折疊方式。
（三）蛋白質空間結構的測定和預測
蛋白質空間結構的測定是研究蛋白質功能的基礎和關鍵，也是當前結構生物學研究的重要內容之一。
蛋白質空間結構測定方法：晶體蛋白——X射線晶體衍射技術
溶液蛋白——核磁共振結構分析技術
此外還有質普法、中子衍射技術等。
蛋白質構象的預測是根據分子構象理論及已知空間結構蛋白質表現出的一些構象規律，用概率統計方法來預測大量已知一級結構蛋白質的構象，可為設計具有特定空間構象的蛋白質提供理論依據，目前主要集中在對二級結構的預測。
利用定點突變等分子生物學技術，改變組成蛋白質分子的某個氨基酸殘基，對現有蛋白質加以定向改造，是蛋白質工程的主要研究內容。這一工作是建立在對蛋白質構象預測基礎上的。如果能預測出產生某種特定新功能的蛋白質構象應具有的氨基酸序列，可減少蛋白質工程的盲目性。
蛋白質工程最引人注目的是從頭設計和構建新的蛋白質分子，創造自然界中不存在的優良蛋白質。
（四）蛋白質的變性
1．變性的定義
蛋白質變性是指蛋白質分子受到某些理化因素作用后，天然構象發生改變，生物活性喪失、某些理化性質發生改變的過程。
物理性質：溶解度下降、沉淀、粘度增加、紫外和熒光光譜發生改變。
化學性質：易被蛋白酶水解，可與多種試劑發生反應。
2．變形因素與作用機制
理化因素，不同因素引起的變性機制不同。
熱變性：溫度升高使分子內振動增強，破壞了維持空間構象穩定的次級鍵及某些二硫鍵。
超聲波：直接破壞某些次級鍵。
酸、堿：使蛋白質所帶的電荷發生改變，離子鍵斷裂，從而導致構象松散。
尿素、鹽酸胍：是常用的蛋白質變性劑，可能是破壞了蛋白質分子中的氫鍵和分子內的疏水力。
表面活性劑（如SDS、Triton X-100）：表面所帶的負電荷改變了蛋白質的電荷分布，使分子構象發生改變。
有機溶劑：改變蛋白質分子中的靜電引力、氫鍵和疏水作用力，使構象發生改變。
3．變性過程
包括寡聚蛋白分子解離成亞基，肽鏈從緊密的三級結構轉變為松散狀態，再從有序的二級結構變成無規則的線團。
但酶在變性時活性喪失在先，分子整體構象變化在后，這表明活性部位先發生構象變化。
4．可逆變性與不可逆變性
變性的蛋白質由于一級結構并未受到破壞，在除去變性因素后，有些蛋白質在適當條件下可由變性狀態恢復為天然構象并表現出生物活性，這種變性稱為可逆變性。不能恢復的稱為不可逆變性。
SDS、巰基乙醇、尿素引起的變性屬于可逆變性，大多數變性是不可逆的。
表明變性蛋白質的體外重折疊與細胞內蛋白質的折疊有相當大的差別，變性的蛋白質無法重新折疊成天然構象。
5．復性
沒有活性的變性蛋白質在適當條件下重新折疊成有活性的天然構象的過程稱為復性。復性的實質是多肽鏈在體外的重新折疊。
重新折疊的機制目前仍不清楚，有些蛋白質可在幾秒鐘內在體外重新折疊而恢復天然構象、生物活性；有些蛋白質的復性需要較長的時間，而大多數蛋白質無法復性。
蛋白質的無法復性可能是由于在體外的重新折疊導致了錯誤的折疊。
（五）蛋白質的變構
蛋白質在發揮功能時由于分子內的相互作用導致蛋白質分子構象發生改變。
變構蛋白都屬于寡聚蛋白，除血紅蛋白和變構酶外還包括細胞膜上的某些蛋白質及基因調控蛋白等，具有許多重要功能。
血紅蛋白的變構效應：血紅蛋白與肌紅蛋白結合氧的特性不同，以氧分壓為橫坐標，氧飽和度為縱坐標，可得到兩種蛋白的氧結合曲線。血紅蛋白為S型曲線，肌紅蛋白為雙曲線。
血紅蛋白的S型氧合曲線反映了它與氧結合的特點。血紅蛋白分子由于4個亞基間的相互作用，四聚體與氧剛開始結合時親和力遠低于肌紅蛋白，分子中的α亞基對氧的親和力比β亞基大，能首先與第一個氧分子結合，導致α亞基的構象發生變化，并進而使相臨的β亞基構象也發生變化，從而增加β亞基對氧的親和力。當血紅蛋白結合上第一個氧分子后，它與氧的結合能力由于變構作用而逐漸增加，呈現S型曲線。
肌紅蛋白由于只有一條多肽鏈，與氧的親和力較大，在很低的氧分壓下即接近飽和。
波爾效應：增加CO2的壓力或H+的濃度都能降低血紅蛋白對氧的親和力，使血紅蛋白的氧結合曲線右移，促進氧的釋放；而高濃度的氧可促使血紅蛋白分子釋放H+和CO2，這種現象稱為波爾效應。
五、蛋白質的分離純化與鑒定
（一）蛋白質分離純化的一般程序
分離純化的一般步驟：
1．選擇一種目的蛋白含量豐富，穩定性好的樣品材料。
2．將蛋白質從樣品中抽提出來。
3．確定分離純化的方法，使粗品的純度達到預定要求。
4．建立靈敏、特異、精確的檢測手段，分步測定蛋白質的含量，檢驗蛋白質的純度。
5．在操作分析過程中注意保護蛋白質的穩定性，防止變性。
（二）前處理
1、生物樣品的選擇與處理
生物樣品選擇的原則是：有效成分含量豐富、穩定性好、來源豐富、保持新鮮、實驗條件恒定、取材工藝簡單、有綜合利用價值等。
選擇好樣品后應及時使用或在-20℃以下冰箱保存。
2．細胞破碎
I、機械破碎法
II、物理學方法：超聲波、擠壓、反復凍溶等
III、化學法：有機溶劑或表面活性劑
IV、酶學法：用適當的酶破壞細胞壁
3．抽提
用適當的溶劑和方法，使有效成分充分溶解到溶劑中的過程。抽提液具備的條件：對有效成分溶解度大、破壞性小、對雜質不溶解或溶解度很小、來源廣泛、價格低廉、操作安全。
抽提過程中應注意的因素：
1）、溶劑的pH值：應偏離蛋白質的等電點，但不宜過高或過低。
2）、溶劑的離子強度：用離子強度較低的中性鹽溶液，鹽濃度在0.02-0.5mol/ml范圍內。與脂質結合牢固的蛋白質用有機溶劑抽提。
3）、溫度：抽提溫度不宜高，應控制在0-10℃。
4）、抽提液的體積：抽提液一般為抽提物的3-5倍。
5）、添加保護劑：加巰基乙醇或EDTA保護巰基形成二硫鍵或與金屬離子結合。
（三）蛋白質的分離純化方法
1．利用溶解度不同的分離純化方法
I、鹽析法
在稀鹽溶液中蛋白質的溶解度隨鹽濃度的增加而升高，這種現象稱為鹽溶。而當鹽濃度增加到一定量時其溶解度逐漸下降，直到某一濃度時從溶液中析出，稱為鹽析。
用于鹽析的中性鹽常用硫酸銨，不同蛋白質鹽析時所需的鹽濃度不同，調節鹽的濃度可適當地將蛋白質分離。對含有多種蛋白質的混合液可采用分段鹽析的方法分離純化。
II、等電點沉淀法
III、有機溶劑沉淀法：（1）降低水的介電常數，使蛋白質分子中帶相反電荷的基團吸引力增大、凝集。（2）與蛋白質爭奪水膜，使蛋白質凝集并沉淀析出。（3）破壞氫鍵，引起構象改變。
IV、聚乙二醇沉淀法：其分子量在400-6000之間。
2．利用分子大小和形狀不同的分離純化方法
I、透析和超濾
II、密度梯度離心
蛋白質顆粒在具有密度梯度的介質中離心時，可根據其分子量和密度的不同進行分離，每種蛋白質顆粒沉降到與自身密度相等的介質梯度時，即停止不前，最后各種蛋白質在離心管中被分離成各自獨立的區帶。
常用的梯度介質為蔗糖。
III、凝膠過濾
3．利用電離性質不同的分離純化方法
I、離子交換層析
II、聚焦層析
III、制備電泳：電泳后使分離區帶從聚丙烯酰胺凝膠管下端流出，用洗脫液洗脫到部分收集器中。
4．利用吸附能力不同的分離純化方法：吸附層析
5．利用生物功能專一性的純化方法：親合層析
（四）蛋白質的純度鑒定
1．電泳法
醋酸纖維素薄膜
瓊脂糖凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳
SDS-PAGE
梯度PAGE
等電聚焦電泳
雙相PAGE
印跡轉移電泳：通過凝膠電泳分離的蛋白質再次經過電泳轉移到固相載體表面，然后進行染色分析電泳帶。常用的載體為硝酸纖維薄膜，醋酸纖維薄膜等。常用于檢測DNA、RNA、蛋白質等之間的相互作用。
毛細管電泳：快速、分辨率高、樣品用量少。
2．免疫法
免疫擴散、免疫電泳、酶聯免疫吸附、免疫印跡
3．分光光度法
4．超速離心
5．高效液相層析
第二講酶學
一、酶的催化機理
（一）酶的化學結構與活性中心
1、酶分子的結構特征
酶的化學本質是蛋白質，其一級結構和空間結構與蛋白質的相同。除少數單體酶外，大多數酶是由多個亞基組成的寡聚體。多數情況下每個亞基有一個活性部位，有些酶的活性部位是由一個以上亞基組成的，對于多功能酶來講不同的亞基有不同的功能。
酶分子中除活性中心外，還有其他的功能部位，如抑制劑、激活劑、別構效應劑結合部位，亞基相互識別、相互結合部位等。
2、酶的活性中心與必需基團
酶分子上和酶活性有直接關系的特異氨基酸殘基，集中在酶分子的一個特定區域，即為酶的活性中心或活性部位。
酶分子活性中心的化學基團，實際上是某些氨基酸殘基的側鏈或肽鏈末端氨基或羧基，它們的一級結構距離較遠，但空間結構相對集中。
活性中心內的化學基團是酶發揮催化作用及與底物直接接觸的基團，稱為活性中心內的必需基團。活性中心外的一些基團，雖不直接參與催化作用，但對維持整個酶分子空間構象及酶的活性是必需的，稱為活性中心外的必需基團。
活性中心內的必需基團又分為催化基團和底物結合基團。
催化基團和結合基團是相互聯系的整體，催化效率的高低很大程度上取決于底物結合的位置是否合適，只有結合基團正確地結合底物，提供催化基團發揮作用的最優構象，才能有效發揮催化作用。
3、酶活性中心的結構
同一酶或功能相近的酶，其活性中心附近的氨基酸序列具有驚人的相似性，而序列的差異常發生在遠離活性中心的地方。不同的酶，其活性中心雖有某些共同的氨基酸殘基，但它們鄰近的氨基酸殘基序列卻很少相同。
酶活性中心出現頻率最高的氨基酸是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。
活性中心的氨基酸殘基在結構上都具有一些特殊的側鏈基團，如巰基酶類的-SH、絲氨基酶類的-OH、組氨基酶類的咪唑基。
酶活性中心有一個疏水的三維環境，具有一定的柔性，在底物誘導下可發生構象的改變，以適宜結合底物的狀態。
輔助因子對酶活性中心的構象和酶的催化性質都有重要影響作用。
酶活性中心研究的方法有：化學修飾法、親和標記、動力學分析法、X-射線衍射分析法、基因定位誘變法。
（二）酶降低反應活化能的機理
1．活化能與過度態
對任何活化反應，反應物分子或底物分子在轉變成產物之前都必需獲得一定的能量成為活化態或過度態。反應物轉變為產物的關鍵步驟是原來的化學鍵斷裂和新化學鍵的形成，而過度態正是這種轉變的中途點。初始反應處于基態能階，產物處于另一基態能階，過度態與反應物的能階之差稱為活化能。
初始反應物要發生反應，必須具有高于或等于活化能的能階水平才有可能進入過度態，因此要使一個化學反應速度加快，一是增加反應物轉化為產物的機率，二是降低反應的活化能水平。
催化劑降低反應活化能的效應是通過改變反應途徑來實現的，使反應沿著低活化能的途徑進行，即使反應途徑分成若干步進行，而各步的活化能都不太大，總的活化能水平較低。
2．酶—底物復合物的生成與酶催化
酶作為生物催化劑之所以能發揮高效的催化性，在于酶和底物反應過程中形成了特殊的酶—底物復合物，此過度態的復合物很不穩定，可即刻轉變成相應的產物，使反應的總活化能降低。
3．降低活化能的因素
過度態中間復合物的形成，導致活化能的降低是酶催化反應的關鍵。
（1）、酶的鄰近效應和定向效應
鄰近效應：是指酶由于具有與底物有較高的親和力，從而使游離的底物集中于酶分子表面的活化中心區域，使活性中心的底物有效濃度得以極大的提高，并同時使反應基團之間相互靠近，增加親核攻擊的機會，從而提高反應速度。
定向效應：指底物的反應基團和催化基團之間或底物的反應基團之間正確地取向
產生的效應。
反應基團的正確取向和定位增加底物的激活，從而加快反應。
對酶催化來說，鄰近和定向效應是共同產生催化效應的。
（2）、底物分子形變或扭曲
酶受底物誘變發生構象改變，活性中心的基團發生位移或改向，但同時酶活性中心的基團可引起底物形變，削弱有關的化學鍵，使底物由基態轉變為過度態，有利于反應進行。
（3）、酸堿催化
酶由于活性中心存在酸性或堿性氨基酸，可作為酸堿催化劑，即可作為催化性質的質子受體或供體，有效地進行酸堿催化。
（4）、共價催化
酶活性中心存在親核基團和親電子基團，可對底物進行親核和親電子反應，形成不穩定的共價中間復合物，降低反應活化能，加速反應進行。
（5）、活性中心的低介電性
酶活性中心是一個疏水的非極性環境，其催化基團被低介電環境所包圍，催化反應在低介電常數介質中的反應速度比高介電常數介質中的快得多。
二、酶促反應動力學
（一）底物反應動力學
在酶促反應中，盡管酶必須參加反應，但酶不被消耗，而只起循環作用，反應速度只依賴于反應物。在其他條件不變，[E]恒定條件下，酶促反應速度與底物濃度之間呈雙曲線關系。
當[S]很低時，V隨[S]增加而迅速增加，V與[S]成正比；當[S]很高時，V隨[S]升高而加速，但V的增加不如[S]低時那樣顯著；當[S]增加到一定值后，再增加底物，V不再增加，達到一恒定值。
這種雙曲線關系是由于底物在轉變成產物之前，必須先與酶形成中間復合物，再轉變成產物并釋放酶。
1931年Michaeleis和Menten在中間產物學說的基礎上建立了V與[S]關系的雙曲線方程，即米氏方程：v=Vm/（Km+[S]）
酶反應速度是衡量酶活性大小的指標，用單位時間內產物的增加或底物的減少來表示。
用[p]對t作圖得酶促反應速度曲線。曲線的斜率即為反應速度，表示單位時間內[p]的變化。曲線上某一點的斜率即為該時刻的反應速度。
根據米氏方程，Km等于反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度，即Km=[S]。
Km在酶學、藥物代謝研究和臨床工作中都有重要作用和應用價值。
（1）、鑒別酶的最適底物
Km的大小可近似地表示酶和底物的親和力，即Km=[E][S]/[ES]。
Km值大表示酶與底物的親和力小，反之則大。具有最小Km值的底物即為該酶的最適底物或天然底物。
（2）、判斷在細胞內酶的活性是否受底物抑制
如果測得離體酶的Km遠低于細胞內的底物濃度，而反應速度沒有明顯變化，表明該酶在細胞內常處于被底物所飽和的狀態，底物濃度的微量變化不會引起反應速度有意義的變化。
（3）、催化可逆反應的酶
當正、逆反應Km值不同時，Km值小的底物所表示的反應方向為該酶催化的優勢方向。
（4）、多酶催化的連鎖反應，確定各酶的Km可尋找代謝過程的限速酶，在底物濃度相似時，Km值大的酶為限速酶。
（5）、由于存在Km值不同而功能相同的酶，從而發現同工酶。
（6）、測定不同抑制劑對某個酶Km及Vm的影響，可區別該抑制劑是競爭性抑制劑還是非競爭性抑制劑。
（7）、測定不同菌株天冬酰胺酶對天冬酰胺的Km值。選用Km值較小的酶，可評價和篩選藥用酶。
Km和Vm的求取：
因酶促反應的米氏方程有雙曲線特征，[S]對V作圖不能準確獲得Vm和Km，所以常用雙倒數作圖法將此方程轉換成直線方程，有作圖的直線斜率、截距求得Km和Vm值。
（二）抑制反應動力學
1．抑制作用的分類
酶分子與配體結合后常引起酶活性改變，使酶活性降低或完全喪失的配體稱為抑制劑，這種效應稱抑制作用。
抑制作用分為不可抑制作用和可抑制作用兩大類，不可抑制作用又分為專一性抑制和非專一性抑制；可抑制作用分為競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制和混合性抑制。
2．不可抑制作用
抑制劑與酶分子上的必須基團共價結合，不能用透析、超濾等物理方法解除抑制，必須通過化學方法才能解除機宜作用，稱不可抑制作用。抑制程度決定于抑制劑濃度及酶與抑制劑間的接觸時間。
專一性抑制劑是一些具有專一化學結構并帶有一個活潑基團的類底物，與酶結合時活潑的化學基團可與酶活性中心殘基或輔基發生共價修飾而使酶失活。
非專一抑制劑可對酶分子上每個結構殘基進行共價修飾而導致酶失活，這類抑制劑主要是一些修飾氨基酸殘基的化學試劑及重金屬離子等。
（1）、有機磷化合物
神經毒氣和有機磷農藥通過與膽堿酯酶絲氨酸的羥基結合而破壞酶的活性中心，使酶喪失活性。由于乙酰膽堿的堆積而引起神經癥狀。
有機磷化合物屬于不可逆抑制劑，可用含C-CH=NOH的肟化物將其從酶分子上取代下來，使酶恢復活性。常用做解毒劑，如解磷啶。
（2）、有機汞、砷化和物
這些化合物能與許多巰基酶的巰基結合而使酶活性喪失，如路易士氣、吡霜類等。
這類抑制劑對巰基酶的抑制作用可通過加入過量巰基化合物，如Cys、還原型谷胱甘肽、二巰基丙醇等使酶恢復活性。
巰基化合物常稱為巰基酶的保護劑，被用做砷、汞等重金屬中毒的解毒劑。
（3）、重金屬離子
重金屬鹽類Ag+、Hg+、Pb+等與酶的巰基、羥基、咪唑基結合，對大多數酶活性具有強烈抑制作用。
金屬離子螯合劑EDTA、Cys可解除其抑制，使酶恢復活性。
（4）、烷化劑
主要是含鹵素的化合物，如碘乙酸、碘乙酰胺等，可使酶中的巰基烷化。從而使酶失活。常用做鑒定酶中巰基的特殊試劑。
（5）、氰化物
氰化物能與含鐵卟啉的酶中的Fe++結合，使酶失活而阻止細胞呼吸。
（6）、自由基對酶類的作用
自由基是指能獨立存在的含有一個或幾個以上未配對電子的原子、原子團、分子或離子。
由于具有未配對電子，所以其性質不穩定，有變為成對電子的傾向，易發生失電子或得電子的氧化—還原反應。
生物體內最多的自由基是含氧自由基，如O2-.、OH.、O1/2.，生理條件下這些自由基不斷產生，不斷清除。過量自由基的產生可造成機體細胞非特異性氧化損傷，如引起DNA堿基修飾、鏈斷裂、酶蛋白變性失活等，從而產生多種病理過程。
自由基可攻擊酶活性部位的基團使酶失活；使生物膜磷脂中的不飽和脂肪酸氧化，產生氧化物，而對細胞產生毒性。
機體的抗氧化防御體系包括抗氧化酶類和非酶類抗氧化劑。抗氧化酶主要是SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶等，可清除細胞內產生的自由基和過氧化物。
非酶類抗氧化劑主要指VE、類胡羅卜素、抗壞血酸等，主要是清除體內產生的自由基。
3．可逆性抑制作用
抑制劑與酶非共價結合，用透析等物理方法可除去抑制劑使酶恢復活性。
（1）、競爭性抑制作用
抑制劑與底物結構相似，可競爭性地結合于酶的活性中心。酶不能同時和S和I結合。
（2）、非競爭性抑制
抑制劑與底物結構不相似，不競爭酶的活性中心，而是和活性中心以外的部位結合，使酶的活性受到抑制。酶能同時和S、I結合形成EIS復合物。
非競爭性抑制在生物體內多表現為代謝中間產物反饋調控酶的活性。
（3）、反競爭性抑制
抑制劑只能與ES結合形成無活性的EIS三元復合物，而不能與游離的酶結合。
（4）、混合性抑制作用
主要表現為非競爭性抑制的混合或非競爭性抑制與反競爭性抑制的混合。
（5）、可逆性抑制作用的應用
I、磺胺類藥物與抗菌增效劑
細菌在生長時不能利用現成的葉酸，只能利用對氨基苯甲酸合成二氫葉酸，然后再轉化成四氫葉酸，參與核酸合成。
磺胺類藥物與對氨基苯甲酸結構相似，可競爭性地結合細菌上午二氫葉酸合成酶，抑制二氫葉酸的合成，使核酸合成受阻，從而抑制細菌生長。
抗菌增效劑與二氫葉酸結構類似，可競爭性地抑制二氫葉酸還原酶，使四氫葉酸合成受阻。
II、葉酸類似物
葉酸類似物，如氨基喋呤、氨甲喋呤可競爭性抑制二氫葉酸還原酶，阻止葉酸還原成二氫葉酸和四氫葉酸，阻斷嘌呤核苷酸的合成而抑制癌細胞生長。
III、嘌呤類似物
嘌呤類似物主要是次黃嘌呤和鳥嘌呤的衍生物，可阻止次黃嘌呤核苷酸轉化為AMP，干擾癌細胞核苷酸及蛋白質的合成。
IV、嘧啶類似物
與嘌呤類似物作用相似，抑制癌細胞DNA合成，如抗癌藥物5-氟尿嘧啶。
V、氨基酸類似物
如重氮絲氨酸、6-重氮-5-正亮氨酸，它們的化學結構與谷氨酸相似，可與天然谷氨酸競爭結合氨基轉移酶類，從而抑制嘌呤核苷酸的合成，具有抑菌作用。
三、酶活性的調節
酶作為生物催化劑的特點：催化的高效性和專一性、反應條件溫和、活性的可調節性。
動物機體代謝調節的本質是通過對細胞內的酶促反應進行有效調節控制來實現的。
酶的調節有兩個方面，一是對已有酶活性的調節，二是對酶的合成與降解的調節。
（一）別構調節
代謝物分子（底物、中間產物、終產物）不直接作用于酶的活性中心，而以非共價鍵結合活性中心以外的別構部位，通過構象的變化而改變酶的活性，這種調節稱為酶的別構調節或變構調節。
此種酶稱別構酶或變構酶，能使酶分子發生別構的物質稱別構效應物或別構效應劑。能使酶活性增強的稱別構激活劑，反之稱別構抑制劑。
1．反饋調節
別構調節是通過反饋方式來實現的，如代謝終產物對原始酶的直接或間接的反饋抑制。
反饋可分為正反饋和負反饋兩種。正反饋使代謝過程加快或酶活性提高，稱正反饋或反饋促進；反之稱負反饋或反饋抑制。
反饋調節是代謝調節中最廣泛最主要的機制，反饋調節還包括代謝途徑以外的任何因子對酶的特異調節。
（1）、反饋抑制的形式
單價反饋抑制：反應過程是直接進行的，不發生分支反應，如長鏈脂肪酸對乙酰CoA羧化酶的反饋抑制。
B、多價反饋抑制：在分支途徑中兩個或兩個以上的終產物共同存在時，抑制共同途徑的起始步驟的酶活性，但終產物單獨存在時不表現抑制作用。
C、協同反饋抑制：幾個終產物同時過量存在時可抑制其共同途徑的第一步驟酶活性，當幾個終產物單獨過量存在時只抑制相應分支途徑的酶活性。
D、順序反饋抑制：當終產物E過量時，對EC抑制，此時中間產物C濃度增加，促進反應向G方向進行，致使另一終產物G增加，此時由于G過量對Ed酶抑制，結果C又過剩，于是對酶Ea抑制，最后使A到B反應減慢。
E、積累反饋抑制：幾個終產物中任何一個過量時都能對共同途徑的某一個酶產生部分抑制作用，各個抑制作用之間互不干擾，當幾個終產物同時過量時它們的抑制作用是積累的。
（2）、反饋抑制的特征
是產物本身來控制產生自己的速度，是控制產物濃度最準確、最經濟的方式。
2．別構酶與別構效應
別構酶是由兩個以上亞基組成的寡聚體，在結構上有明確的調節部位和催化部位，兩個部位可在同一個亞基上，也可分別位于不同的亞基上，彼此能相互影響產生協同效應。底物和別構劑能各自專一地與同一酶結合，別構劑結合在別構部位，結合后調節部位和催化部位發生構象改變，主要指亞基間嚴緊型與松弛型間的轉變。
別構酶底物具有協同效應。當配體（底物與小分子效應劑）與酶蛋白結合后，影響另一配體和酶蛋白的結合，導致酶催化活性的改變。這種效應稱協同效應。協同效應是多亞基別構酶的基本特征。
根據兩個配體是否相同和影響是促進還是減慢協同效應分為同促和異促、正協同和負協同效應。
別構酶的動力學特征與調節：
別構酶的動力學曲線不服從米氏方程，酶反應初速度與底物濃度不是矩形雙曲線，而是呈S形曲線。
別構酶的S形曲線表明，對別構酶來說酶反應速度對底物濃度的變化極為敏感。因此在細胞內當底物發生很小變化時別構酶可以極大程度地調節反應速度。
3．別構調節機理
（1）、MWC模式——能反映正協同效應
別構酶是由兩個以上亞基組成的寡聚酶，各亞基占有相等的、物理位置相對稱的排列。
每個亞基對一種配體只有一個結合位點。
每種亞基都以松弛型和嚴緊型兩種構象狀態存在，并保持平衡。
兩種構象狀態可以互變，構象轉變采取同步協同方式。
構象狀態轉變時分子對稱性不變。
多個配體結合到酶的特異結合部位上，各個配體與R型和T型結合的位點都相等。
（2）、KNF模式——正負協同效應
A、當配體不存在時別構酶只有T型一種構象狀態存在，而不處于R、T的平衡狀態；只有當配體與之結合后，才誘導T型向R型轉變。
B、構象改變是序變方式進行的，而不是齊變。當配體與第一個亞基結合引起該亞基構象變化，并導致鄰近其他亞基發生構象改變。
C、亞基間的相互作用可能是正協同效應，也可能是負協同效應。
4．別構調節的生理意義
同促效應是對底物濃度改變作出的調節效應。
同促正協同效應時酶具有S型動力學性質，對較小的底物濃度變化，酶反應能作出靈敏的應答，在代謝途徑中只有關鍵地位的酶調節具有重要生理意義。
同促負協同效應時酶具有表觀雙曲線動力學性質，反應速度對底物濃度的變化相對不敏感，這一特點對體內那些和條代謝途徑有聯系的酶來說，可保證其能穩定正常地工作。
（二）酶的化學修飾
酶蛋白肽鏈上某些殘基，在另一種酶的催化下發生可逆共價修飾，而引起酶活性改變的過程，稱酶的化學修飾。
酶的化學修飾包括：磷酸化與脫磷酸化，乙酰化與脫乙酰化，腺苷化與脫腺苷化，-SH與-S-S-互變，尿苷酰化與脫尿苷酰化，ADP-核糖基化，甲基化與脫甲基化等。其中磷酸化與脫磷酸化在代謝調節中最為重要和常見。
蛋白激酶催化磷酸化，特異的磷酸酶催化脫磷酸。被修飾的酶在活性形式與非活性形式之間互相轉變。通過共價修飾改變酶的構象，調節酶的活性。
化學修飾的特點及意義：
（1）、絕大多數修飾調節酶具有無活性與有活性兩種形式，它們互變反應中正逆兩個方向由不同的酶催化。
（2）、此種酶促反應是級聯反應，修飾因子使第一個酶發生酶促共價修飾后，被修飾的酶又可催化另一種酶分子發生共價修飾，每修飾一次，就可將調節因子的信號放大一次。
（3）、磷酸化是最常見的酶促共價修飾反應，是生物體調節酶活性經濟而有效的方式。
（4）、化學修飾調節常與別構調節相互協作，增強了調節因子的作用。別構調節是細胞的基本調節機制，對維持代謝和能量平衡很重要。但當別構效應劑濃度很低時而不能發揮足夠的調節作用，即可通過化學修飾反應，引起有效酶活性的迅速改變和相應的生理反應。
（5）、酶的化學修飾是生物體內快速而普遍的調節方式，對糖代謝、細胞生長和發育、基因表達、神經遞質的合成與釋放有主要作用。
（三）限制性蛋白水解對酶活性的調節
限制性蛋白水解是一種不可逆且高特異性的共價修飾調節系統，如酶原的激活、血液凝固、補體激活等，在蛋白質合成過程中起著切除、修飾和加工等重要作用。
調節的特點：
（1）、受這種調節的酶都以酶原形式合成和分泌，當需要時被相應的蛋白酶切除小肽鏈而激活。
（2）、由酶原轉變為酶是不可逆的。
（3）、激活過程顯示協同級聯、快速的放大效應。
（4）、被激活的酶在完成其特定功能后，能及時地從靶部位被解除。
（5）、受這種調節的酶主要是一些消化酶和執行防御功能的酶。
四、核酶的催化作用
核酶是由Cech和Altman（1989年度諾貝爾化學獎）1982年提出的，具有催化作用的mRNA。
一）、概述（與蛋白質酶相比較）
（1）、化學本質：是RNA，其催化活性及催化特異性都為其結構和特性所決定。由A、C、G、U四種堿基組成，以堿基互補方式與底物結合。
（2）、底物：主要為RNA。
（3）、反應特異性：具有嚴格的堿基特異性。
（4）、催化效率：催化效率較低。
（5）、產物：集底物、產物于一身。
（60、在生命活動中起重要作用。
2、核酶的分類
（1）、根據催化反應的種類分為四類：I類內含子的自我剪接
II類內含子的自我剪接
自身催化的剪切型
異體催化的剪切型
（2）、作用機制：I、剪接型：催化自身剪接，具有內切酶和連接酶兩種活性。
II、剪切型：催化自身RNA或異體RNA一段RNA的剪除，具有內切酶活性。
（3）、作用底物：I、自身催化：以自身為底物進行自我剪切和剪接。
II、異體催化；以異體為底物。
二）、剪接型核酶
其作用機制是通過既剪又接的方式除去內含子或居間序列，連接外顯子，生成成熟RNA。
內含子是各種RNA初級轉錄產物前體待剪接序列。
1、內含子的自我剪接：存在于真核細胞一些RNA前體。
（1）、剪接機制
rRNA前體中內含子的環化。
第一次轉酯反應：鳥苷化合物中G的3’-OH作為親核基團向5’外顯子與內含子5’剪接點的磷酸酯鍵進行親核攻擊，5’外顯子脫落，3’外顯子與內含子相連。
第二次轉酯反應：5’外顯子的3’-OH作為親核基團攻擊3’外顯子與內含子的3’剪接點連接的磷酸酯鍵，形成新的磷酸二酯鍵，而外顯子相連生成rRNA，同時釋放內含子。
L-19內含子的形成：釋放的IVS可進行自身環化，即線性內含子的3’—OH攻擊其5’端的磷酸二酯鍵，從5’端脫下15個核苷酸片段，并連接為環狀中間產物，開環后再剪切下4個核苷酸，最后得到一個丟失19個核苷酸的線性IVS，即L-19 IVS。L-19內含子具有多種酶的活性，可催化多種以RNA為底物的反應，如核苷酸轉移反應、磷酸轉移反應、RNA限制性內切反應等。
（2）I類內含子的二級結構
包括P1-P10的堿基對區，P、Q、R、S序列，突環、單鏈區，剪接位點，結合位點。不同的I類內含子序列的相似性很小，但都有一系列短的保守序列，P/Q，R/S配對區和P、Q、R、S未配對序列，在P1和P10處有5’端和3’端剪接位點，由IGS堿基對組成。G結合位點主要成分是在P9的G-C堿基對。
2、II類內含子的剪接：II類內含子存在于植物的線粒體、葉綠體及真菌中。
（1）、剪切機制
套環形成：內含子中位于3’剪接位點的餓一個A的2’-OH作為親核基團對5’剪接位點的磷酸酯鍵進行親核攻擊，使5’剪接位點斷開。由2’,5’-磷酸二酯鍵連接形成套環結構。
外顯子連接：5’外顯子的3’-OH作為親核基團對內含子3’剪接位點進行親核攻擊，兩個外顯子以3’,5’-磷酸二酯鍵相連，形成成熟的RNA，并釋放帶有套環的內含子。
（2）、II類內含子的二級結構
II類內含子的二級結構由6個結構域組成。結構域I有兩個保守的外顯子結構序列，分別與兩個內含子結構序列相互配對，有5’和3’端邊界序列GUGYG和AY。結構域V高度保守，為催化活性所必需，并與結構域I結合，形成催化核心。結構域VI是一個含有套環分支點的螺旋結構。
三）、剪切型核酶
1、自身催化剪切型RNA
（1）、錘頭結構
由三個雙螺旋區包括有13個核苷酸殘基是保守序列的中心區或核心結構，及連接堿基對的任意發夾環組成。由催化部分和底物部分組成。
（2）、發夾結構
由4個螺旋區和數個環狀結構組成。螺旋區有6個堿基對組成，II由4個堿基對組成，III由5個堿基對組成，IV有5個堿基對的螺旋結構區，需要有3對配對堿基存在，有兩個內部環將I、II區與III、IV區分開。剪切位點有5個堿基組成，GUG是最常見的剪切部位，剪切反應發生在GUG的5’端。
（3）、斧頭結構——人肝炎病毒HDV
有三個堿基對的莖（I、II、III），在III處有一個單鏈的RNA開放區。莖II發夾環處起分為酶及底物部分。
2、異體催化剪切型
核糖核酸酶P（RNase P）是內切核酸酶，能剪切所有的tRNA前體。
RNase P由M1 RNA和蛋白質亞基組成。單獨的M1 RNA具有催化活性，但單獨的蛋白質則不具有催化活性。
第三講核酸化學
一、核酸的結構
（一）DNA的結構
1．DNA的一級結構
動物染色質DNA是雙螺旋線型。線粒體、細菌及某些病毒是雙螺旋環狀。少數幾種病毒是單鏈線型或環狀。
DNA主要由A、G、C、T和少量稀有堿基如m5C組成。各種生物堿基組成規律：
腺嘌呤與胸腺嘧啶完全相等。G與C完全相等。嘌呤總數與嘧啶總數完全相等。A+C=G+T A/T=G/C。
堿基組成具有種的特異性，既不同的物種DNA具有自己獨特的堿基組成。
堿基組成不具有組織器官特異性，同一生物各組織器官具有相同的堿基組成。
年齡、環境、營養狀態不影響DNA堿基組成。
DNA的一級結構是4種脫氧核苷酸按一定的方式、數量、排列順序形成的多核苷酸鏈。
一個脫氧核苷酸的C3’-OH與一個C5’-P以3’—5’磷酸二酯鍵相連形成糖-磷酸骨架，堿基在內側，3’端為-OH，5’端為-P，書寫時按5’→3’方向。書寫用縮寫式如dACGT或5’ dACGT3’等，表式脫氧核苷酸的結構。
真核生物DNA一級結構中，常有一些重復序列。
①高重復序列：重復頻率高，從幾十萬次到幾百萬次，重復序列較短，5~300bp，多數為5~15bp。重復序列中有些是反向重復序列，即該片段堿基順序在互補鏈方向正讀反讀都相同，稱回文結構。
有些反向重復序列中間被一些不相關的順序隔開，形成十字形結構，在十字形兩頭形成發夾環。
高重復序列中還有一種由簡單重復單位組成的重復序列，重復單位由2~10 bp，成串排列。
高重復序列堿基組成不同于其它部分，可用等密度梯度離心法將其與主體部分分開，稱為衛星DNA。根據重復頻率和重復序列長度不同又分為小衛星DNA和微衛星DNA。衛星DNA是一種較好的分子遺傳標記。
高重復序列可參與DNA復制及基因表達調控。
②中重復序列：重復頻率和序列長度有很大差異，平均長度為6×105bp，平均重復350次，在DNA一級結構中可成串的排列在一個大的區域，也有的與單拷貝序列間隔排列，有些序列不編碼蛋白質，有些序列編碼蛋白質。
中重復序列具有種的特異性，可作為探針區分不同種哺乳動物細胞DNA。
③低重復序列——單拷貝序列
序列不重復或只重復幾次、十幾次，長度大于1000bp，攜帶大量遺傳信息，編碼多種蛋白質，有的是基因間隔序列。
2、DNA的二級結構
DNA的二級結構是Waston和Crick于1953年提出的雙螺旋結構模型。其要點如下：
①主鏈：有兩條反向平行的脫氧多核苷酸鏈組成。雙鏈圍繞螺旋軸以右手方向盤繞成雙螺旋。磷酸-脫氧核糖位于螺旋的外側，構成螺旋的主鏈，堿基位于螺旋的內側。
②堿基對：兩條鏈的堿基通過氫鍵聯系在同一平面上形成堿基對，A--T,G--C。兩種堿基對氫鍵間的距離、堿基兩側與其C-1’連接之間距離及C-1’與核苷酸構成的角度相同。
③螺距：雙螺旋螺距為3.4nm，包含10個堿基對。每兩個相鄰堿基平面的垂直距離為0.34nm，直徑為2.0nm 。相鄰堿基對之間的螺旋角度為36°。
④大溝和小溝：兩條主鏈和堿基并不充滿雙螺旋的空間，表面形成大小兩條凹下去的槽，稱大溝和小溝。這是由于堿基對上下大小不同及堿基對兩側的脫氧核糖是不對稱的而形成的。兩種溝內都具有形成氫鍵的氫供體和受體，但結構不同。大溝比小溝寬而深，易與DNA蛋白質酶等相互作用。
這種模型為B-DNA，隨著DNA分析技術的發展，DNA的雙螺旋不是均勻的，整個螺旋不是垂直而是彎曲的，許多結構參數是隨堿基序列的不同而有一定范圍的波動，如旋轉角度等。
穩定雙螺旋結構穩定的因素有：互補堿基間氫鍵，堿基堆積力（堿基平面之間的范德華力和疏水作用力），離子鍵（外側磷酸基的負電荷與介質中的陽離子之間形成的離子鍵）。
DNA雙螺旋的多態性：
DNA在不同條件下存在有不同的雙螺旋結構，具有多態性。如：A、A’、B、B’、C、C’、D、E、Z等。
①A-DNA：
DNA纖維鈉鹽在濕度為75%時，B-DNA轉變為A-DNA。
A-DNA的右手螺旋比B-DNA大且較平，每轉一圈的螺距為2.8nm，每一圈的堿基對數為11，堿基距離0.255nm，堿基旋轉33°。堿基平面與中心軸不垂直，而成20°傾斜，大溝窄而深小溝淺。
②Z-DNA
結構特征：
a：以二聚體dGC或dCG為一個單位，由六個這樣的單位構成一個左手螺旋。磷酸基團走向成Z型。螺旋直徑為1.8nm。每轉一圈包括12個堿基對，螺距為4.5nm。
b：G--C堿基對不是對稱的位于螺旋軸附近移向邊緣，G位于DNA分子表面成六面對稱排布，表面有窄而深的小溝。

影響Z-DNA形成與穩定的因素：
①單價、二價金屬離子有利于Z-DNA的形成與穩定。多胺等促進Z-DNA的形成與穩定。
②具有嘧啶、嘌呤交替相間的序列有利于Z-DNA的形成。
③胞嘧啶或鳥嘌呤的甲基化可形成穩定的Z-DNA。
④組蛋白H2A、H2B、H3、H4穩定Z-DNA而組蛋白H1和H5不利于Z-DNA的形成。
⑤在有適當堿基序列的部位解旋時，促進Z-DNA的形成。
三螺旋DNA的結構分為分子間、分子內、和平行三螺旋DNA三類
三螺旋DNA的結構分為分子間、分子內、和平行三螺旋DNA三類.
①堿基組成及配對：
三螺旋是在雙螺旋的結構基礎上形成的
三鏈區的三條鏈均由同型嘌呤或同型嘧啶組成。根據堿基組成及結構的不同分為嘧啶-嘌呤-嘧啶型（Y。RY型）：TAT、CGC，嘌呤-嘌呤-嘧啶型（R。RY型）：AAT、GGC。堿基配對方式，第三個堿基以A--T、G--C配對只形成兩對氫鍵，在R。RY型上還存在G--G、A--A每一型中堿基配對具有高度的序列特異性。
②分子間三螺旋DNA：
合成的脫氧多核苷酸在一定條件下DNA雙螺旋的特定區插入雙螺旋結構的大溝內，通過氫鍵的形成局部的分子間三螺旋結構，并與雙螺旋一起旋轉。
③分子內三螺旋DNA：
DNA雙螺旋特定區通過氫鍵作用發生自身折疊形成局部分子內三股螺旋結構，同時游離出一段DNA單鏈。如H-DNA，其內的主要序列成為H-回文序列。
④平行的三螺旋結構：
三螺旋結構中的第三條鏈的序列，方向與第一條鏈的相同稱為R-DNA。
近年來的研究表明，在真核細胞染色質中，發現許多基因的調控區和染色質的重組部位含有三螺旋DNA結構，應用單鏈DNA片段可將切割劑攜帶到DNA的特定位點，從而達到選擇性切斷有害基因或病毒基因的轉錄。對三螺旋DNA的研究有助于認識真核基因結構，復制、轉錄、調控和重組的機理。
3、DNA的三級結構
DNA的三級結構是指DNA雙螺旋進一步扭曲盤繞所形成的構象。包括線型雙鏈中的扭結、超螺旋、多重螺旋、分子內局部單鏈環、連環等。超螺旋是最常見的一種。
①超螺旋
環狀DNA、線形雙螺旋兩端連接進一步扭曲可形成負超螺旋。向右手扭曲形成正超螺旋。
天然存在的超螺旋多為負超螺旋。如細菌質粒、噬菌體、大腸桿菌染色體DNA、真核細胞染色體DNA的。
自然界中大多數DNA分子都以超螺旋結構存在。其意義在于：1、密度大、體積小，在細胞中所有體積較為經濟；2、能影響雙螺旋的解鏈程度，因而影響DNA分子與其他分子的相互作用，參與DNA的復制、重組、轉錄等功能。
（2）染色體DNA的三級結構
真核細胞染色體DNA的二級結構是線性雙螺旋，三級結構是雙螺旋盤繞在組蛋白上的負超螺旋結構。這種以組蛋白為核心，盤繞以DNA片段的顆粒稱核小體。
核小體是染色體的基本結構單位，每一個核小體上的DNA熟練是因生物種類和組織不同而異。完整的核小體由核小體核心與連接蛋白組成，核心是由組蛋白H2A/H2B、H3/H4與DNA結合形成的八聚體，連接蛋白由組蛋白H1和20-80bp的DNA構成。許多核小體形成念珠線形結構的核小體鏈，然后盤繞形成染色質纖維，再進行盤曲形成染色單體。
線粒體DNA的結構
線粒體DNA是雙鏈環狀分子，兩個鏈的堿基組成顯著不同。重鏈含有較多的G，輕鏈含有較多的C。有一個長度不同的D環。D環含有2個啟動基因（P1、P2），3個保守序列CSB（I、II、III）和一個終止序列；有2個復制起始點（OH、OL）；重鏈是2種Rrna、14種Trna和12種多肽的模板，輕鏈是8種Trna和1種多肽的模板。線粒體基因排列緊密，沒有間隔區，基因長度變化小，兩端不存在非編碼序列，很少有重復序列，無內含子。
4、DNA的理化特性。
①分子大小：分子量104~107，堿基對107bp。長度可達數厘米，由于分子很長，有一定脆性，極易受剪切力的作用而折斷。
②紫外吸收特性：由于嘌呤和嘧啶堿基形成共軛雙鏈而具有紫外吸收性質，最大吸收波長260nm，此特性可用于測量核酸的濃度及其純度。
③變性與復性：
變性：能破壞氫鍵和疏水鍵的因素都能導致雙螺旋的破壞。
變性因素：加熱、極端pH、有機溶劑、尿素、酰胺等。
DNA由雙螺旋結構轉變成無規則卷曲單鏈，稱DNA變性。變性理化性質發生很大變化，260nm處紫外吸收值增高、黏度下降、沉降系數增加、浮力密度上升等。
熱變性在較窄的溫度范圍內發生，引起DNA變性溫度稱熔點（Tm）。DNA Tm在70~85度之間。
溶液離子種類和強度影響DNA的穩定性，離子強度低時，Tm值低，熔點范圍較窄；離子強度高時，熔點范圍較寬。
DNA分子堿基組成的均一性和分子中G+C的含量可影響其Tm 值。均一性DNA Tm值較窄，非均一性DNA Tm值較寬。G+C含量高的DNA，Tm值較高。亦較穩定，所以，Tm值可作為測定DNA樣品均一性的指標，及推算DNA堿基組成。
復性：
除去變性因素后，變性DNA的兩條鏈重新結合起來，恢復到原來雙螺旋結構的過程稱為DNA復性。
復性后DNA的一系列理化性質得到恢復，真核DNA重復頻率高的序列復性速度快，重復頻率低的則慢。序列簡單、濃度高、片段大的DNA復性快。
（4）核酸分子雜交：
相同或不同來源的兩個DNA或DNA和RNA分子如果含有彼此互補的序列，混合在一起，通過變性和復性處理，DNA-DNA同源序列間及DNA-RNA異源序列間形成DNA-DNA或DNA-RNA雜交體，稱為核酸分子雜交。
核酸探針（基因探針）：有目的合成從基因組中分離一段已知序列的DNA，使帶上標記，竟變性后成為單鏈，在一定條件下與待測DNA單鏈雜交，如兩序列有同源性即互補，形成帶有標記的雙鏈DNA分子，以達到探測位知DNA的目的。
（二）RNA結構
1．RNA的結構特征
（1）堿基組成：A、G、C、U及少量稀有堿基，堿基含量沒有A--U、G--C的比例關系。
（2）一級結構：四種單核苷酸按一定方式、數量和排列順序形成多核苷酸鏈稱為RNA一級結構。細胞RNA分子一般為線形單鏈分子。
（3）RNA構象：RNA二級結構由雙螺旋或堿基對區、內部環、單堿基突起和突環、發夾環或多分支環、單鏈區、甲結構成。
雙螺旋區：RNA單鏈迂回折疊形成，一個或數個長短不一的局部雙螺旋結構。
內部環：RNA鏈中不互補的堿基突出形成環狀突起。內部環的堿基數目可以是對稱的也可以是不對稱的。
單堿基突起：在一個連續的雙螺旋中突起一個堿基。
發夾環：對于雙螺旋末端兩面連接的雙鏈區域，類似發夾結構。
多分支環：是連接三個以上螺旋的環區。
甲結：是二級結構中環區再加上堿基配對形成。是幾個螺旋區交叉的一種形式。
單鏈區：位于RNA分子的端部。
（4）RNA的空間結構：
單鏈RNA分子通過折疊形成二級和三級結構。二級結構既有單鏈區又有雙鏈區。種類和功能不同的RNA有其特征的二級或三級結構，種類和功能相同的RNA二級或三級相同或相似。
2．mRNA
二級結構沒有共同的形態和規律。原核生物和真核生物mRNA結構不同。
（1）原核生物mRNA的結構。
典型的多順反子結構即一個操縱子編碼的幾條多肽鏈。5’端無帽子結構，沒有修飾核苷酸，不含稀有堿基，3’端沒有多聚A序列，二級結構存在豐富的自身回折形成的雙鏈區，有發夾結構。
（2）真核生物mRNA結構
含有少量稀有堿基，由5’的帽子結構、5’非編碼區、編碼區、3’非編碼區和3’多聚A尾組成。
①5’帽子結構：是5’存在甲基化核苷，即：m7GpppNm.，對mRNA的翻譯活性很重要。
②3’多聚A結構：存在于3’端的多聚A結構，是轉錄后由腺苷酸聚合酶催化加上的，對mRNA的穩定、翻譯效率有調控作用。
③編碼區：帶有特異性蛋白質遺傳信息的翻譯區，是肽鏈氨基酸序列的編碼序列。
④非編碼區：存在5’和3’端，兩個非編碼區分別包括5’帽子結構、起始密碼和終止密碼、多聚A結構，非編碼區參與翻譯過程和起調控作用。
3．tRNA
（1）tRNA一級結構特征
①單鏈小分子
②含有較多的稀有堿基或修飾堿基，其中以甲基化堿基較多；
③3’端都是…CCA-OH結構；
④5’端總是磷酸化的，大多數為小pG；
⑤表現出進化的保守性，有二十多個位點上的核苷酸是不變的；
⑥大多數tRNA第54到57位存在TΨCG序列。
（2）tRNA二級結構
是三葉草結構，有5個臂組成，即：氨基酸臂、二氫尿嘧啶臂、反密碼子臂、胸苷假尿苷胞苷臂和可變臂。每個臂由兩部分組成，一部分堿基配對形成雙螺旋，另一部分以單鏈形式形成一個小環。①氨基酸臂：由7個堿基對組成的局部雙螺旋區和3’端CCA-OH組成，可接受活化的氨基酸。
②二氫尿嘧啶臂由三個堿基對組成，短雙螺旋區和由7到10個核苷酸形成的二氫尿嘧啶環。
③反密碼子臂：由5個堿基對構成的短雙螺旋區和7個核苷酸形成的反密碼子環，其中三個核苷酸組成反密碼子，與Mrna相應的密碼子互補。
④胸苷甲尿苷胞苷臂：由5對堿基組成的雙螺旋區和7個核苷酸圍成的TΨCG組成。TΨCG環使Trna與腺粒體的大亞基相互結合。
⑤可變臂：有3到21個核苷酸組成的可變化的含量多者可形成小雙螺旋。
5．hnRNA、snRNA、snoRNA
（1）hnRNA
又稱不均一核RNA存在于真核生物細胞核中，分子量不均一，是mRNA的前體，在核質中由RNA聚合酶Ⅱ轉錄而成，初級轉錄產物不含5’帽子和3’polyA結構。在核質量經過加工修飾成有帽尾結構的hnRNA，再經剪接和甲基化修飾轉變成成熟的mRNA.
hnRNA與蛋白體、結合成核內不均一的核糖核蛋白顆粒（hnRNP），參與mRNA剪接加工成熟過程。
（2）snRNA
又稱作核內小RNA，是一類小分子RNA，分布于細胞核中，與蛋白質結合在一起形成小分子細胞核核蛋白顆粒（snRNA），與Mrna前體組成剪接體，參與Mrna的剪切，加工。
（3）snoRNA
又稱作小分子核仁RNA，存在于真核生物細胞核內，參與Rrna的加工，影響Rrna，及其前體的形成等。
6．反義RNA
指能與有義mRNA互補結合的單鏈RNA。廣泛存在于自然界。原核生物由反義基因轉錄而來。真核生物來自于mRNA同一DNA區。即由反鏈轉錄而來。
反義RNA是生物體內重要的調控物質，可在多層次對基因的表達進行調控。
二 DNA的復制
（一）DNA復制過程基本要點
1．半保留復制
復制過程中，DNA兩條鏈分開，分別以每一條鏈為模板合成新的互補鏈，產生兩個與原來DNA分子堿基順序完全一樣的子代DNA分子，每個子代DNA分子的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈是新合成的，這種復制方式稱半保留復制。
1958年Meselson and Stahl用14NH4CL為氮源的培養基培養大腸桿菌時證實了半保留復制。
半保留復制是雙鏈DNA的普遍復制機制。單鏈DNA在復制時，也要先形成雙鏈的復制形式。
2．復制的起始點、方向和方式
復制是從DNA分子上特定位置開始的。這一位置稱復制原點。方向大多以雙向進行，也有一些以單向進行。復制正在發生的位點叫復制叉，雙向復制可形成兩個復制叉。
（1）復制的起始點
原核生物只有一個起始點，真核生物有幾個或多個復制起點。其共同特點是都富含A.T序列。是引發復制的蛋白因子結合的位點。不同生物中A.T序列長度不同。
（2）復制的方向
復制從特定位置開始，大都雙向進行，也有一些是單向的。向一側單方向進行的復制稱為單方向復制，向兩側進行的復制叫做雙向復制，向兩側復制但移動是不對稱的稱不對稱雙向復制。
（3）復制方式
①眼型：復制區域形如一個眼睛，復制隨眼形結構的擴張最終擴張到整個復制子，有單向和雙向兩種。
②θ型：復制眼形成類似θ結構，發生在環狀DNA分子中。有雙向和單向復制，多數為雙向等速復制。
③D環型：線粒體DNA的復制呈現D環型。
線粒體DNA是環狀雙鏈DNA。兩條鏈的復制是不對稱的，先以新代分子中的負鏈為模板，合成一條新鏈，當合成進行到一定距離時，暴露本身一條鏈的復制點，從該點開始，以正鏈為模板，合成一條新鏈，兩者的合成方向相反。由于起始點不在同一位置，所以合成的起始時間不同。復制是不對稱進行的。
④滾環型：
某些病毒、噬菌體DNA復制時形成滾環型。當環型DNA分子復制時，先由一核酸內切酶從正面的一個位置打開一個缺口，使3’和5’端游離出來，3’端做為引物，在DNA聚合酶催化下，以負鏈為模板，連續合成一條新鏈，形成環狀雙鏈子代DNA，以原有的正鏈為模板連續或不連續合成一條負鏈最后形成一線形或環狀雙鏈分子。
3．復制的方向：從5’→3’。
4．復制的半不連續性
DNA復制在有條鏈上以5’→3’的方向連續合成，這條鏈成為前導鏈，在另一條鏈上，先按5’→3’方向合成許多與復制叉方向相反的崗崎片段（1968年，崗崎發現），隨著復制叉的移動，許多不連續的崗崎片段在DNA連接酶的作用下，連接成一條完整的DNA鏈。這條鏈稱隨從鏈。
5．模板和引物
模板為DNA。
引物是在DNA的復制過程中，每段崗崎片段復制時都要先合成一小段RNA作為引物，復制才能進行，引物是引發DNA合成的。
6．引發和引發體
①DNA分子上一段短的區域發生熔解反應，雙鏈分離成單鏈區域，由解旋酶使雙螺旋解開，單鏈結合蛋白使雙鏈解開，并覆蓋在單鏈上。
②解旋酶沿DNA移動形成復制叉。
③在引物合成酶的作用下，形成一小段RNA引物，引發復制，引發過程中由若干蛋白和酶形成一個引發體。引發酶在隨從鏈上向復制叉方向前進，在隨從鏈上斷斷續續地引發生成隨從鏈的RNA引物。在前導鏈上引發只進行一次。
7．鏈的延伸
鏈的延伸是在DNA聚合酶催化下，按模板的要求，在引物的3’-OH加上新的核苷酸。大腸桿菌DNA聚合酶有I、II、III三種。酶III是延伸的主要酶。
8．鏈的終止
在單向復制的環狀分子中，復制的終點就是復制原點。在雙向復制環狀分子中沒有固定的終點。
DNA鏈延長結束后，DNA聚合酶I的作用下切除RNA引物，該酶具有5’→3’外切酶的功能。去除引物后留下的空缺由酶I催化填補，然后在又DNA連接酶將DNA片段連接起來。
9．復制忠實性的保證
為了保證復制的忠實性，生物體內具有確保復制忠實性的機能。DNA聚合酶具有3’→5’外切酶活性，可專門水解不配對的堿基，該酶在聚合開始時具有選擇正確堿基的能力，同時有一種校對作用，刪去誤配的堿基，保證復制的高度忠實性.
（二）復制過程所需主要酶類及相關蛋白
1．DNA聚合酶
DNA聚合酶的特點：
①以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物；
②反應需接受模板指導；
③反應需有引物3’-OH存在；
④雙鏈的伸展方向為5’→3’；
⑤產物DNA性質與模板相同。
（1）大腸桿菌DNA聚合酶
酶I：
①DNA聚合酶活性：通過核酸聚合反應使DNA鏈沿3’→5’方向延長。
②3’→5’外切酶活性：由3’端水解DNA鏈。
③5’→3’外切酶活性：由5’端水解DNA鏈。
3’→5’外切酶活性能切除單鏈DNA的3’末端。正常聚合反應中3’→5’外切酶活性受抑制，當出現錯配堿基對，聚合反應停止，由3’→5’外切酶切除錯配堿基，聚合反應才能繼續進行。
5’→3’外切酶活性只用于雙鏈DNA，從5’端水解下核苷酸或寡核苷酸，如崗崎片段中5’引物的切除。
酶II：
催化由5’→3’方向合成DNA反應，只有3’→5’外切酶活性，而無5’→3’外切酶活性。
其生理功能還不太清楚。
酶III：
與酶I一樣具有3’→5’， 5’→3’外切酶活性。酶III在復制過程中起主要作用。其酶由多亞基組成的點不對稱兩臂的大分子。這樣可適于同時復制復制叉的前導鏈和隨從鏈的合成。隨從鏈的模板在復制叉前進處圍繞DNA聚合酶III的一個臂彎曲成環，使隨從鏈片段在5’→3’合成時也于復制叉前進方向一致。當隨從片段合成接近前導片段5’末端時，模板被釋放，模板上的環消除，合成的隨從鏈片段其5’→3’方向轉為與復制叉方向相反。合成下一片段時，模板再成環、環再消除等。
（2）真核生物DNA聚合酶。
真核生物DNA聚合酶活性與大腸桿菌DNA聚合酶活性相似。有α、β、γ、δ和ε5種。
酶α：同與酶III，由多亞基組成，是真核生物DNA復制的主要酶。常伴有引物合成酶。引物可以是DNA或RNA。
酶β：能一人工合成的DNA為模板，引物為寡聚脫氧核糖核苷酸。可能在DNA的損傷修復中起作用。
酶γ：模板與引物與酶β相同，可能與線粒體DNA復制相關。
酶δ：天然DεNA需沒Dnase處理活性后才能作為模板和因物。具有3‘→5‘外切酶活性。
酶ε：其性質與δ相似。
ε和δ的生物功能尚不清楚。
2．DNA連接酶
催化DNA切口處形成3’，5’-磷酸二酯鍵。目前應用的有大腸桿菌DNA連接酶、T4DNA連接酶。二者的區別：①輔助的因子不同（大-NAP；T4-ATP）。②底物不同，大腸桿菌DNA連接酶，只連接雙鏈DNA中的單鏈缺口，只能實現粘接，不能實現DNA雙鏈間的平接。T4DNA連接酶，既能實現DNA雙鏈間的粘接，有能實現平接。
3．單鏈結合蛋白（SSB）
SSB能刺激同源DNA聚合酶的活性。使天然DNA熔點降低，單鏈DNA與其結合后，能抵抗核酸酶的水解，可與解開的兩條單鏈結合，穩定單鏈以利于其發揮模板作用，促進復制進行。
4．DNA解旋酶
是一類通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA的酶。復制時DNA解旋酶可以沿著隨從鏈模板的5’→3’方向隨著復制叉的前進而移動。Rep蛋白前導鏈模板的3’→5’方向移動. Rep蛋白和DNA解旋酶在DNA兩條鏈上協同作用,以解開雙鏈DNA.DNA解旋酶還同時有引發酶的功能.
5．拓撲異構酶
酶I：①雙鏈DNA超螺旋和送松弛態之間的轉換。
②單鏈互補DNA的正鏈與負鏈形成雙環結構。
③單鏈結狀DNA和無結狀DNA之間的轉換。
④雙鏈環狀DNA的環連或解環連作用。
酶II：使DNA的正超螺旋轉變為負超螺旋狀態。使DNA兩條鏈同時切開，同時利用水解ATP的能量，使雙鏈結開，讓一條DNA穿過斷口，再將切斷的末端重新關閉起來，形成負超螺旋。
6．引物酶
引物是一種特殊的RNA聚合酶，催化RNA引物的合成。引物酶作用需要有其他蛋白質因子存在，即需要有引發前體的存在。
引發前體包含多種蛋白因子PriA、B、C ,dnaA、B、D、T。引物酶與引發前體兩者聯合，組成引發體。
7．端粒酶
是一種核糖核蛋白酶，是一種特殊的DNA聚合酶，屬于反轉錄酶。由RNA和蛋白質構成，以其中一段RNA序列為模板，延伸染色體的3’端解決DNA復制時引起的末端隱縮。
端粒酶RNA亞單位的結構在不同真核生物之間差別很大，其蛋白質組分至少有兩個以上多肽亞單位組成。
端粒酶能把端粒序列加到染色體末端，以補充染色體末端的自然丟失。在缺乏有效延伸機制時，端粒在歷經每次細胞分裂之后即縮短。
（三）原核生物DNA復制模型和真核生物DNA復制特點
1．原核生物DNA復制模型
凱恩斯模型（θ型）：
大腸桿菌和噬菌體DNA以此模型復制。
復制機制：①復制從雙鏈特定的復制點開始。
②分別以正負兩鏈為模板，以雙向方式進行。
③正鏈膨大負鏈變形，逐漸形成θ型DNA分子。新生子鏈隨母鏈正負鏈內外側延伸。
④延伸到一定程度閉環，形成兩個子代DNA分子
（2）滾換式模型
如φχ174噬菌體與單鏈環狀DNA的復制。復制時先以單鏈正鏈為模板合成一條互補鏈，形成環狀雙鏈復制型。
復制機制：①雙鏈DNA分子的正鏈被內切酶切開一個缺口，露出3’-OH和5’磷酸末端
②正鏈的一端固定在細胞膜上，以環狀閉和的負鏈為模板，以正鏈的3’-OH為引物，復制新的正鏈
③負鏈隨正鏈的延長而滾動，使模板上尚未復制的核苷酸轉到正鏈的延伸點，使正鏈的復制持續進行。
④拉成現狀的正鏈的5’端部分逐漸延長，并進行直線伸展的復制
⑤新生的子鏈延長到一定程度后，在連接酶作用下成環，線狀伸展部分也卷曲成環，形成兩個子代環狀DNA分子。
這種雙鏈DNA分子可在內切酶作用下在正鏈切一切口，使正負鏈分開，形成一個單鏈DNA分子。
2．真核生物DNA復制的特點
（1）同原核生物一樣都是半保留復制。
（2）原核生物只有一個復制起始點，一個DNA分子就是一個復制子。真核生物DNA上有許多復制起始點，每個復制起始點，不固定在某一DNA序列處，每個起始點左右各有一個終止點，形成一個復制單位即復制子。不同生物，同一生物不同生長條件下，其復制子大小不同，同一DNA上其復制子大小不均一。
（3）從復制起始點開始向左右進行，形成復制叉。許多復制叉碰在一起，最后完成整個DNA復制過程，形成兩個子代DNA分子。
（4）原核生物DNA復制可以雙向進行，也可以單向進行。真核生物DNA復制絕大多數雙向進行，少數單向進行。
（5）原核生物復制起始點可連續進行新的復制。真核生物DNA在完成生命復制之前，每個起始點不能開始新的復制。
（6）真核生物線粒體DNA的復制類似于凱恩斯模型，是單向不對稱的半保留復制，即D環型。
（四）DNA的損傷修復
1．DNA的損傷：
由于某些物理和化學因素的作用引起DNA序列發生變化，造成DNA損傷。
這些變化包括：堿基的丟失、堿基的插入、堿基的變化、DNA鏈的斷裂和交聯、堿基二聚體的形成等。
2．DNA損傷的修復
（1）光復活：可見光激活了光復活酶，它能分解由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體
這種修復由于高度專一性，只作用于由紫外線照射形成的嘧啶二聚體。從低等生物到鳥類都有，但高等動物沒有。
（2）切除修復：在一系列酶的作用下，將DNA分子中損傷部分切除，并以完整的鏈為模板，合成出切除的部分，使DNA恢復正常結構的過程。
（3）重組修復：損傷的DNA片段上出現缺口，從完整的母鏈上將相應的核苷酸序列片段移至缺口處，然后用再合成的序列來補上母鏈的缺失。
（4）SOS反應：是細胞DNA受到損傷或復制系統受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現的應急效應。
SOS反應能誘導切除和重組修復中有關的酶和蛋白質的產生，加強切除和重組修復的能力。
SOS反應還能誘導產生缺乏校對功能的DNA聚合酶，能在DNA損傷部位進行復制而避免了死亡，卻帶來很高的變異率，在某種情況下允許錯配，以增加存活的機會。
是原核和真核生物在不利環境中求得生存的一種基本功能。
（五）RNA 指導的DNA的合成——逆向轉錄
1．逆轉錄酶：由αβ兩個亞基組成。催化活性與DNA聚合酶相似，具有三種活性：
（1）RNA指導的DNA聚合酶活性（逆轉錄）。
（2）DNA 指導的DNA聚合酶活性（合成雙鏈 DNA）。
（3）3’→5’和5’→3’核酸外切酶活性。
由mRNA 3’-端polyA，可通過逆轉錄酶以mRNA為模板，轉錄出cDNA構建cDNA基因文庫，篩選出特異的結構基因。
2．逆轉錄病毒
致癌RNA病毒逆轉錄酶，稱逆轉錄病毒。
病毒雙鏈DNA形成后即即時進入細胞整合到宿主DNA進行轉錄。
3．逆轉錄的生物學意義
（1）逆轉錄病毒和嗜肝經過逆轉錄，整合到宿主細胞后可引起癌癥和肝炎，如果能尋找到逆轉錄酶的專一性抑制劑，可以防止致癌作用，為治療腫瘤提供重要線索，同時對這類病毒進行改造，可成為向細胞內部引入外源遺傳信息的工具，用于腫瘤和遺傳疾病的基因治療。
（2）AIDS病毒是一種逆轉錄病毒。研究這類病毒的逆轉錄過程可了解它的起因和尋找防治途徑。
（3）真核生物基因組中RNA逆轉錄基因的發現，表明真核生物正常細胞內也存在逆轉錄過程。
三、基因轉錄與轉錄后加工
DNA的轉錄產物為mRNA、tRNA、rRNA。
編碼mRNA分子的基因為結構基因，終產物為蛋白質。
編碼tRNA、rRNA分子的基因為結構基因，終產物為tRNA、rRNA從不被翻譯成蛋白質。
轉錄過程中與轉錄產物RNA分子序列相同的鏈為編碼鏈；與編碼鏈互補的DNA鏈在轉錄過程中作為指導RNA合成的模板，稱為模板鏈。
啟動子上轉錄合成為RNA的第一位堿基稱為轉錄開始點。DNA上轉錄開始部位的特殊區稱為啟動子。轉錄終止的序列稱終止子。
從啟動子到終止子之間的全部DNA序列稱轉錄單位。一個轉錄單位可包括多個基因。
轉錄開始點以前為上游，以后為下游。書寫轉錄過程從左到右。
書寫DNA僅寫編碼鏈。轉錄開始點為+1，開始點前為-1，下游方向計數增加，上游方向計數絕對值增加。
（一）原核生物基因的轉錄
1．RNA聚合酶
E.coli RNA聚合酶催化E.coli三類RNA的合成。RNA聚合酶的Vm比DNA聚合酶低的多。因此，DNA復制時速度快，鏈延伸僅在少數點進行。轉錄速度慢，可在很多點進行，其結果是細胞中富集的RNA分子比DNA多。
RNA聚合酶與DNA聚合酶模板的精確性不同。RNA聚合酶對模板的精確性低，因為RNA聚合酶缺乏外切核酸校對功能。
RNA聚合酶由2個α亞基，β、β’、δ和ω亞基組成，α亞基的功能是RNA合成的起始有關，β亞基的功能參與RNA合成的起始及延伸，β’亞基的功能是與DNA結合，δ亞基的功能是識別轉錄的啟動子，增加核心酶與啟動子結合的特異性，ω亞基的功能不清楚。除掉δ亞基的酶稱核心酶。核心酶有催化活性，但沒有特異性。
2．轉錄過程
（1）、轉錄起始
RNA聚合酶全酶與模板DNA非特異性結合，并向啟動子移動，而后與啟動子特異結合，形成緊密的啟動子復合物，啟動子處DNA雙鏈解開，形成開放啟動子復合物。
（2）、啟動子識別
啟動子位于DNA模板5’端大約10bp的富含A、T的起始序列中。起始序列中含有TTGACA和TATAAT兩個保守序列。分別位于-35bp和-10bp處，稱-35區和-10區。-35區和-10區的數個核苷酸是啟動子上開放啟動子復合物的主要接觸點。
（3）、轉錄延伸
RNA聚合酶與啟動子形成開放啟動子復合物后，RNA聚合酶催化第一個核苷酸與DNA模板結合，鏈延伸起始，δ亞基從核心酶解離，核心酶沿DNA模板移動，同時解開模板雙螺旋，暴露單鏈模板，當RNA合成大約12bp時，DAN雙鏈再形成雙螺旋，使轉錄產物與模板分離。
當RNA聚合酶到達DNA鏈終止信號處時，轉錄終止。
（4）、轉錄終止
細菌轉錄終止有兩種方式，一種需要終止因子ρ的終止，另一種不需要終止因子的終止。
ρ因子與轉錄產物5’端特異位點結合，然后向轉錄產物的3’端移動，在解旋酶的催化下解開轉錄產物的3’端與模板間的雙鏈，使轉錄產物釋放。
不需要終止因子的終止方式的基因3’端具有兩個特點，一個是在轉錄產物中有兩個富含GC的片段，可形成莖環結構；另一個是其下游有4-8個A殘基。
當RNA聚合酶遇到第一個富含GC的片段時，由于穩定的GC堿基對使模板很難解旋，RNA聚合酶暫停移動。轉錄產物中富含GC部分相互配對，由于A-U鏈的連接，使轉錄產物與模板間的連接作用減弱，導致轉錄產物從模板上解離下來，完成轉錄終止。
3．轉錄后加工
（1）、mRNA轉化
原核生物初始轉錄產物mRNA在其自身合成過程仍在進行時就開始翻譯，翻譯后很快降解，因此mRNA不需要加工修飾。
（2）、rRNA和tRNA的轉錄后加工
rRNA和tRNA都分別是合成大的轉錄產物，然后對轉錄產物進行剪接，形成成熟的RNA分子。編碼rRNA和tRNA的DNA總數不到基因組的1%。
rRNA的轉錄后加工：rRNA轉錄產物包括16S、23S和5SrRNA及1-4個tRNA序列，轉錄仍在進行時核糖體蛋白顆粒就可安裝到RNA前體上，然后剪接成成熟的rRNA。
tRNA的轉錄后加工：轉錄出來的tRNA兩側有很長的序列，先在核糖核酸酶的作用下從5’-端剪切，形成tRNA 5’-端結構，然后核糖核酸酶D從3’-端剪切，形成tRNA 5’-端CCA結構，最后再進行甲基化、硫醇化等堿基修飾，產生稀有堿基。
（二）真核生物基因的轉錄
1．真核生物RNA聚合酶
（1）、酶I
位于核仁中，催化rRNA前體的合成，活性最強。
（2）、酶II
由8-12個亞基組成，其顯著特征是最大亞基有羧基末端結構域（CTD）。CTD結構由多個7氨基酸殘基的重復序列組成，原核生物及真核生物的其他RNA聚合酶沒有此結構。CTD結構是RNA聚合酶II轉錄活性所必須的，如部分或全部CTD的重復單位丟失，則細胞不能存活。CTD的磷酸化和去磷酸化作用，可影響RNA聚合酶II的功能。
酶II位于細胞核包括轉錄mRNA前體及一些小核RNA。
（3）、酶III
由9-15個亞基組成。酵母RNA聚合酶III的兩個大亞基與E.coli RNA聚合酶的β、β’亞基同源，兩個小亞基與原核生物RNA聚合酶的α-亞基同源，有6個特有的小亞基，其中一個具有亮氨酸拉鏈結構，一個有酸性末尾，一個與酶的裝配有關，其余的與tRNA的合成有關，大亞基與轉錄的終止有關。
酶III位于細胞核，負責轉錄tRNA前體、及一些小RNA。
2．真核基因啟動子
（1）、RNA聚合酶I啟動子
酶I識別的啟動子是編碼rRNA基因的啟動子，核心啟動子位于轉錄開始點的周圍，從-45—+26bp處，促使轉錄起始。位于上游-180—-107bp處的控制元件可增加啟動轉錄的效率。這兩個啟動子區有獨特的堿基組成，富含GC堿基對。
酶I還需要兩個輔助因子UBF1和SL1。UBF1與核心啟動子和UCE的有關序列特異結合，SL1不與啟動子特異結合，但協助UBF1的結合，延長覆蓋DNA的區域。一旦兩個因子結合，RNA聚合酶I就與核心啟動子結合使轉錄起始。
（2）、RNA聚合酶II啟動子
在所有組織中都表達的結構基因，其轉錄起始點的上游區有一個或多個拷貝的GC盒，其結構類似原核生物的啟動子。只在一種或少數幾種細胞中表達的結構基因，如珠蛋白基因等缺少GC盒，但含有與轉錄起始有關的特征序列：a、TATA盒，類似于原核生物啟動子的Pribnow盒，決定轉錄的正確起始，但與原核啟動子不同的是原核基因缺少Pribnow盒不能轉錄，而真核基因缺少TATA盒仍能轉錄，只是轉錄的效率下降，產物5’端不均一；b、CCAAT盒，位于TATA盒的上游，決定轉錄起始的效率；c、CACCC盒，位于CCAAT盒的上游，提供酶II結合位點及參與調控的結合蛋白的結合位點。
（3）、RNA聚合酶III啟動子
酶III啟動子不在轉錄起始點上游，而在基因編碼區內。啟動子分A、B兩個區域，A區在5’端，B區在3’端，稱斷裂啟動子。A、B區域內堿基發生突變，將會降低轉錄效率。但兩者之間的距離不影響轉錄的起點和終點。
3．結構基因的轉錄與加工
（1）、轉錄的起始
真核生物結構基因的轉錄是在RNA聚合酶II的催化下進行的，起始過程中酶II與多種蛋白因子結合于啟動子上形成轉錄起始復合物。
A、轉錄起始復合物
TATA盒結合蛋白（TBP）。TFII-B、F、E、H、D與酶II結合在啟動子上形成轉錄起始復合物。酶II沿模板滑動時TFII-D留在轉錄起始位點上。
B、基因轉錄的通用因子
（1）TFII-D：由TBP與8種組分組成的蛋白質復合物，不僅決定RNA聚合酶II的轉錄起始位點，還參與CAAT盒等上游元件對基礎轉錄速率的調節。
（2）TFII-B：是緊接在TFII-D后加入轉錄起始復合物的因子，具有參與俘獲RNA聚合酶II的作用。
（3）TFII-F：由兩個亞基組成，參與RNA鏈的延伸，并具有DNA解旋酶的活性。
（4）TFII-E：不直接與DNA結合，通過TFII-B與DNA結合，參與調節TFII-H的磷酸激酶活性。
（5）TFII-H：由多亞基組成，具有DNA解旋酶和蛋白激酶活性，參與RNA鏈的延伸和核苷酸剪切修復過程。在轉錄-修復的連接上發揮重要作用。
（6）TFII-A：對TFII-D與TATA盒的結合起穩定作用。
（2）、轉錄的延伸
在鏈延伸因子的作用下，酶II轉錄起始復合物脫離轉錄起始位點，RNA鏈開始延長。
（3）、轉錄后加工
轉錄出的前mRNA分子含內含子及旁側區，就在核內經過加工之后轉運到核外進行翻譯。
加工包括在3’-端加上Poly尾巴，約200個堿基，5’-端加上m7GpppNm帽子，及剪切掉其內所含的內含子，一些核酸snRNA參與剪接過程。
四、蛋白質生物合成
1．遺傳密碼的性質
密碼子由三個堿基組成，代表一個氨基酸，翻譯從起始密碼子開始，從mRNA的5’端到3’端方向不重疊連續閱讀密碼子，一直到終止密碼子停止。
4種堿基組成64種密碼子，而體內只有20種氨基酸，多密碼子代表一種氨基酸。UAA、UAG、UGA為終止密碼子。
（1）、簡并
簡并指多種密碼子編碼同一種氨基酸，代表一種氨基酸的密碼子稱同義碼或同義詞。除色、蛋氨基酸只有一種密碼子外，其他氨基酸均有兩種以上密碼子。AUG、GUG既是起始密碼子又代表特定氨基酸。
（2）、密碼子不同位置的堿基特異性
密碼子的前兩個堿基特異性強，第三個堿基具有一定靈活性，第三位的G和U在任何密碼子中均沒有特殊意義，A在氨基酸的密碼子中也一樣。
密碼子的靈活性和簡并性可使有些突變只是引起核苷酸序列的改變，而不引起蛋白質中氨基酸序列的改變，從而把突變對生物體的影響降低到最小。
（3）、通用與例外
在所有生物體內密碼子幾乎是通用的，但在人和牛的線粒體內存在例外：a、AUA是蛋氨酸而不是異亮氨酸；b、UGA不是終止密碼子而是色氨酸密碼子；c、AGA和AGG不是精氨酸密碼子而是終止密碼子；d、除AUG外，AUA、AUC、AUU也不做起始密碼子。
（4）、密碼子閱讀方向與mRNA編碼方向一致，從5’到3’。
（5）、密碼子不重疊，無逗點。
2．密碼子與反密碼子的相互作用
tRNA的反密碼子通過堿基反向配對識別mRNA的密碼子。兩者之間堿基配對不嚴格遵守堿基配對原則，而是搖擺配對，即前兩對嚴格遵守標準的堿基配對原則，第三對（密碼子的第三位與反密碼子的第一位）允許有一定的自由度，可出現GU、IU、IC、IA配對。
因此，tRNA識別的密碼子的數目由其反密碼子的第一為堿基的性質來決定。
（二）核糖體
1．核糖體的組成
核糖體是蛋白質合成的場所，有RNA和蛋白質組成。
（1）、原核生物70S核糖體由50S的大亞基（16S rRNA和21種蛋白質）和30S的小亞基（23S rRNA、5S rRNA和34種蛋白質）組成。
（2）、真核生物80S核糖體由40S小亞基（16S rRNA和33種蛋白質）和60S rRNA（28S、5.8S、5S rRNA和49種蛋白質）組成。
2．核糖體的活性位點
核糖體可分為翻譯區和逐出區，有A位、P位、轉肽酶活性位點、EF-TU位點、EF-G位點、5rRNA位點、mRNA位點、逐出位點等9個活性位點。
（1）、mRNA結合位點：位于30S亞基頭部，在S1蛋白等因子協同下與mRNA結合。
（2）、P位點：大部分位于30S亞基，與起始tRNA結合。
（3）、A位點：位于50S亞基，與氨基酸tRNA結合。
（4）、轉肽酶活性位點：位于A位與P位連接處，具有轉肽酶活性。
（5）、5SrRNA位點、EF-TU位點、轉位因子EF-G結合位點、GTP酶活性位點
3．多聚核糖體
在生物體細胞內大多數核糖體處于非活性穩定狀態而單獨存在，少數核糖體與mRNA一起形成多聚核糖體。每一個核糖體上都單獨合成一完整的多肽鏈。
（三）原核生物蛋白質生物合成的過程
1．氨基酸的活化與轉運
活化的過程是氨基酸在酶的催化下，同ATP作用，產生氨基酰-AMP-酶復合物，即活性氨基酸。
氨基酸的轉運是活化氨基酸在氨基酰-tRNA合成酶催化下轉移給tRNA生成氨基酰-tRNA。
2．合成起始
合成起始是tRNA、30S亞基、50S亞基與mRNA結合形成70S起始復合物。
（1）、IF3促進70S亞基解離，并與30S亞基結合，然后mRNA與30S亞基結合。
（2）、IF2結合于起始tRNA，然后再于30S亞基結合，使起始tRNA進入30S亞基的P位。
（3）、50S亞基與30S亞基結合，GTP水解釋放能量，形成70S起始復合物，同時IF2、IF3釋放，A、P位處于正確的構象。
3．肽鏈的延伸
當70S起始復合物形成后，P位被起始tRNA占據，A位空著，然后相應氨基酰-tRNA進入A位，在延伸因子（EF-TU、EF-TS、EF-G）的作用下，轉肽酶把P位上的氨基酰或肽基轉移到A位，形成肽鍵，然后GTP酶水解將A位的肽基-tRNA移到P位上，同時將P位上空載的tRNA逐出核糖體，mRNA向前移動一個密碼子。
每增加一個氨基酸，即重復該過程一次，從而使肽鏈不斷延伸。
4．終止和肽鏈的釋放
當mRNA模板上出現終止密碼子，不能被tRNA所識別，但可被釋放因子（RF1、RF2、RF3）所識別，肽鏈合成終止。在釋放因子的作用下將合成的肽鏈從核糖體釋放，并促使大小亞基解離及與mRNA模板脫離。
四、真核生物蛋白質生物合成
1．合成起始
真核生物蛋白質合成起始過程中需要蛋氨酰-tRNA、GTP、ATP和12種eIF參與。
（1）、起始氨基酰-tRNA與GTP和eIF2形成復合物，然后與40S亞基結合形成前復合物。
（2）、在起始因子的作用下消除mRNA 5’端非翻譯區的二級結構，40S起始復合物與mRNA結合。
（3）、40S起始復合物由mRNA 5’帽子處沿非翻譯區移動，直到第一個AUG處。起始氨基酰-tRNA識別起始密碼子。
（4）、40S起始復合物在AUG處正確定位后，起始因子從40S亞基上解離下來。60S亞基與40S亞基結合形成80S起始復合物。
2．肽鏈的延伸
真核生物普遍存在延伸因子eEF-1、eEF-2，真菌中還有eEF-3。
eEF-1有單體和多聚體兩種，單體的功能與原核生物的EF-Tu類似，多聚體的功能與原核生物的EF-Ts類似，eEF-2的功能與EF-G的相似。
肽鏈的延伸過程與原核生物類似，在eEF的參與下通過進位、肽鍵形成和移位三步反應循環進行，使肽鏈不斷延長。
3．合成終止
真核生物有一種釋放因子——eRF，能識別三種終止密碼子。當核糖體移到終止密碼子時，由于沒有氨基酰-tRNA能識別，eRF因子識別終止密碼子，并與之核糖體結合形成復合物，引起肽鏈釋放，核糖體與mRNA解離，肽鏈延伸終止。
原核生物與真核生物蛋白合成的區別：
（1）、起始因子不同
原核生物：IF-1無專一功能，可增加IF-2、IF-3的活性；IF-2使起始氨基酰-tRNA選擇性地與30S亞基結合，需要GTP；IF-3使30S亞基與mRNA起始部位連接，具有解離活性，使亞基保持解離狀態。
真核生物：eEF-1無專一活性，參與多個步驟；eEF-2被GTP活化，使起始氨基酰-tRNA與40S亞基結合；eEF-2A參與起始tRNA與核糖體的結合；eEF-3促進核糖體解離成40S和60S亞基；eEF-4A與mRNA結合，具有解旋酶活性；eEF-4B刺激eEF-4F和eEF-4A的活性；eEF-4C促進40S亞基與mRNA及60S亞基的結合；eEF-4D功能不詳；eEF-4F識別mRNA的帽子結構；eEF-5釋放起始因子，結合60S亞基與核糖體；eEF-6保持60S亞基的解離狀態。
（2）、起始復合物形成過程不同
原核生物；起始復合物為70S，由50S和30S亞基組成。起始tRNA為甲酰氨基酰-tRNA，需三種起始因子參與。起始復合物的形成順序為：30S亞基與mRNA結合、起始tRNA與30S-mRNA復合物結合、40S亞基與30S亞基結合形成70S起始復合物、mRNA起始密碼子前有起始序列。
真核生物：起始復合物為80S，由40S和60S亞基組成。起始tRNA為蛋氨酰-tRNA，需12種起始因子參與。起始復合物的形成順序為：40S亞基與起始tRNA結合、40S-起始復合物與mRNA結合、60S亞基與40S亞基結合形成80S起始復合物。起始密碼子前無前導序列。
（3）、延伸因子不同
原核生物：有三種。EF-Tu促進氨基酰-tRNA進入A位；EF-Ts促進GDP與GTP交換；EF-G促進移位反應。
真核生物：有兩種。eEF-1單體與EF-Tu功能相似。eEF-1聚體與EF-Ts功能相似，eEF-2促進移位效應。
（4）、釋放因子不同
原核生物：有三種。RF-2可識別UAA、UAG；RF-2可識別UAA、UGA；RF-3有刺激RF-1、RF-2的作用。
真核生物：只有一種。RF可識別三種終止密碼子。
（五）蛋白質合成后的處理加工
1．肽鏈中氨基酸殘基的共價修飾
包括乙酰化、甲基化、磷酸化、轉氨基化、糖基化等。
2．除去N-端起始氨基酸
成熟的蛋白質N-端大部分不是起始的蛋氨酸或甲酰蛋氨酸，必須在相應酶的催化下除去。
3．信號肽的切除
在原核生物和真核生物中合成的蛋白質N-端都有一長為15-30氨基酸的信號肽，形成發夾狀α-螺旋結構，在內膜表面的信號肽酶作用下切除信號肽。
4．肽鏈的折疊
肽鏈合成沒有結束時折疊便已開始，三級結構的形成和肽鏈合成的終止同時完成。
5．切除前體中功能不必須肽段
合成的蛋白質前體中有些是功能不需要的肽段，在專一性蛋白水解酶的作用下，切除多余的肽段。
6．二硫鍵的形成
兩個Cys的巰基氧化形成二硫鍵。
7．多肽鏈N端和C端的修飾
有些蛋白質合成后多肽鏈N端可被乙酰化修飾，C端被酰胺化修飾等。
六）、蛋白質生物合成的抑制劑
主要是一些抗生素如四環素、鏈霉素、氯霉素、紅霉素、嘌呤霉素等。
五、基因表達的調控
在生活中并非所有的基因都一起表達，在特定的細胞或特定的時間內，許多基因都被關閉，只有少數基因被表達，決定某個特定基因是否表達的過程即基因表達的調控。
（一）概述
1．順式作用元件和反式作用因子
基因活性的調控主要通過順式作用元件與反式作用因子相互作用而實現。
順式作用元件是對基因表達有調節活性的DNA序列，其活性只影響與其自身同處在一個DNA分子上的基因，這種DNA序列通常不編碼蛋白質，位于基因旁側或內含子中。
反式作用因子：通常是蛋白質，其編碼基因與其識別、結合的靶核苷酸序列不在同一個DNA分子上，其作用是合成場所擴散到其發揮作用的其他場所。
2．結構基因和調節基因
結構基因是編碼蛋白質或RNA的任何基因，其編碼的蛋白質有結構蛋、酶和調節蛋白。
調節基因：參與其他基因表達調控的RNA和蛋白質的編碼基因。
調節基因編碼的調節物通過與DNA上的特定位點結合控制轉錄。調節物與DNA特定位點的相互作用能以正調控的方式調節靶基因，也能以負調控方式調節靶基因。
3．啟動子和終止子
位于轉錄單位開始和結束位置上的序列為啟動子和終止子。啟動子位于基因轉錄起始點的上游，負責基因轉錄的起始。終止子終止基因的轉錄。
啟動子和終止子是受同一類反式作用因子識別的順式作用元件。
4．操縱基因和阻抑蛋白
阻抑蛋白阻止基因的表達，與操縱基因結合。
操縱基因與啟動子相鄰，是阻抑蛋白的靶位點。當阻抑蛋白與操縱基因結合時會阻止RNA聚合酶啟動轉錄，基因表達被關閉。
5．轉錄子
參與轉錄正調控的反式作用因子是轉錄因子，轉錄因子是轉錄起始過程中RNA聚合酶所需的輔助因子。
在真核生物無轉錄因子時基因處于無活性狀態，RNA聚合酶不能啟動轉錄，轉錄因子在啟動子附近有作用位點，轉錄因子與其作用位點的結合啟動RNA聚合酶轉錄。
（二）原核生物基因表達的調控
1．乳糖操縱子
（1）乳糖操縱子模型
乳糖操縱子由調節基因、操縱基因和3個結構基因組成。結構基因z、y、a分別編碼β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷透性酶和堿性半乳糖苷轉乙酰基酶。
誘導物存在時三種酶水平增加，乳糖可自身乳糖操縱子。
（2）、乳糖操縱子調控
調節基因的產物是大分子阻抑蛋白，活性形式的阻抑蛋白可與DNA上的操縱基因結合，阻斷轉錄。
阻抑蛋白上有誘導物結合位點，可結合誘導物。阻抑蛋白與誘導物結合后使阻抑蛋白失活，降低與DNA的親和力，使結構基因轉錄。
乳糖及相似的誘導物可與阻抑蛋白結合，誘導結構基因的轉錄，這種調節是負調控。
（3）、葡萄糖對乳糖操縱子的調控
在含葡萄糖和乳糖的培養基中大腸桿菌首先利用葡萄糖作為能源，用完葡萄糖后激活乳糖操縱子，從而利用乳糖繼續生長，這是一種轉錄激活過程。當葡萄糖水平低時，通過細胞內cAMP來實現控制。
當葡萄糖水平低時，cAMP水平升高，通過與CRP結合后增強了與DNA特定位點的親和力，cAMP-CRP復合物與DNA上的特定位點結合，激活乳糖操縱子，從而促進轉錄。
2．SOS調節子
一系列受同一機制調節不相連接的基因稱調節子。
SOS調節子中的控制成分是LexA和recA基因的產物。RecA蛋白在重組過程中刺激DNA鏈配對，參與重組修復。LexA是一阻抑蛋白，能與E.coli基因組中至少15種不同的操縱子結合，每個操縱子控制一個或多個蛋白質的轉錄，從而幫助細胞應答環境的傷害。這些蛋白質有的參與切割修復，有的參與控制細胞分裂。
在健康細胞中LexA和RecA表達的很少，有足夠的LexA蛋白關閉SOS基因的合成。損傷后單鏈DNA引發SOS系統激活，RecA與裂口處結合，激活蛋白水解。細胞內LexA含量下降，解除了LexA對recA轉錄的阻礙。
3．色氨酸操縱子
色氨酸操縱子由啟動子-操縱基因調節區和5個結構基因組成；調節區的前面有一個編碼阻抑蛋白的trpR基因，在結構基因的前面有一個前導區，其內含有弱化子序列。
色氨酸可與阻抑蛋白結合形成復合物，是阻抑蛋白的活化形式，它與操縱子結合，阻斷轉錄。
當細胞內色氨酸濃度低時，色氨酸-阻抑蛋白復合物解離，釋放阻抑蛋白，阻抑蛋白離開操縱基因，激活轉錄。
當細胞內濃度高時，弱化子序列內形成莖環結構的轉錄終止子，轉錄在此處終止。
trpR系統和弱化子系統在不同細胞內色氨酸水平上發揮的作用不同，色氨酸濃度低時，以阻抑蛋白-操縱子相互作用調控為主，而色氨酸濃度高時，以弱化作用調控為主。
4．原核生物基因表達與翻譯水平的調控
（1）反義RNA調控
反義RNA是以DNA編碼鏈為模板轉錄出的RNA，能與mRNA配對，從而抑制mRNA的翻譯。能控制一些原核和真核基因的表達。
（2）應急應答調控
細菌細胞環境中營養缺乏時采用應急應答調控，如當氨基酸缺乏時，從ATP和GDP合成一種新的化合物——5’-二磷酸-鳥苷-3’-二磷酸(ppGpp)、ppGpp可抑制操縱子轉錄的起始，使轉錄減慢。
（3）對mRNA半衰期的調節
原核生物mRNA的半衰期約為2-3min，許多因素可影響mRNA的半衰期，從而影響基因表達。降解速度決定mRNA半衰期的長短，mRNA的降解由3’外切核酸酶來完成。
（4）mRNA分子內二級結構對翻譯的影響
mRNA本身的二級結構可通過影響翻譯過程而調控基因的表達。
（5）蛋白質合成的自體調控
細菌內有些蛋白質能控制自身mRNA的可翻譯性，這些蛋白質在mRNA上有結合位點，可控制翻譯的起始或提前終止翻譯來調控。
（三）真核生物基因表達的調控
真核基因表達的調控主要是轉錄起始水平的調控。
1．染色體水平上的基因活化調節
基因被轉錄激活后正常的染色體結構被打亂。轉錄前染色體結構發生變化是基因轉錄的前提。染色質由緊密的壓縮狀態“開啟”為可轉錄的疏松結構，這種疏松結構的形成與DNA的結構、組蛋白的修飾及其他DNA結合蛋白的利用有關，其中主要是組蛋白的磷酸化和核心組蛋白的修飾。
2．基因轉錄的順式調節元件
（1）啟動子
RNA聚合酶II的啟動子有含TATA盒的典型啟動子和不含TATA盒的非典型啟動子兩種。
A、TATA盒啟動子：有TATA盒的典型啟動子是上游啟動子和增強子產生誘導效應所必需的。有時一個基因上串聯著兩個TATA盒，可分別對不同的誘導物作出應答。在某些情況下，也參與組織特異性的選擇。
B、非典型的啟動子：少數基因沒有典型的TATA盒啟動子序列，有的無TATA盒啟動子的序列富含GC盒，有的沒有GC盒。
①富含GC，無TATA盒的基因轉錄
這種基因轉錄起始是不規則的，只有基礎水平表達。持家基因是維持細胞正常結構、基本生命活動所需的蛋白質的編碼基因。5’上游沒有TATA盒，只有富含GC的序列，其中常有一個以上對基礎轉錄的活化有主要作用。SP1結合位點有多個轉錄起始點。
②無TATA盒、GC盒的基因轉錄
TATA盒與轉錄起始子是決定轉錄起始位點的關鍵序列，在轉錄起始子上游加入TATA盒或GC盒可明顯提高轉錄起始子的轉錄效率。
（2）增強子
增強子是真核細胞中通過啟動子來增強轉錄的一種遠端遺傳性控制元件，可位于基因的5’-端、3’-端或基因內的內含子區，跨度為100-200bp。同啟動子一樣由多個獨立的、具有特征性的核苷酸序列組成。
①增強子的特性：A、提高同一條DNA鏈上靶基因的轉錄效率；B、對同源或異源基因同樣有效；C、位置可在基因5’上游、基因內或3’下游序列中；D、在DNA雙鏈中沒有5’與3’固定的方向性；E、可在遠離轉錄起始點起作用；F、具有組織或細胞特異性；G、活性與其在DNA雙螺旋結構中的空間方向性有關。
②增強子作用的機制
有三種方式：A、影響模板附近的DNA雙螺旋結構，以蛋白質之間的相互作用為媒介形成增強子與啟動子之間“成環”連接的模式活化轉錄；B、將模板固定在細胞核內特定位置，有助于DNA拓撲異構酶改變DNA雙螺旋結構的張力，促進RNA聚合酶在RNA鏈上的結合和滑動；C、增強子區可以作為反式作用因子或RNA聚合酶進入染色體結構的“入口”。
③增強子的種類：細胞特異性增強子、誘導性增強子。
（3）沉寂子：是一種負調控元件，參與基因表達的負調控。
（4）轉座元件：由于轉座元件的插入會帶來新的DNA結合蛋白的特異性序列及其結合位點，這些序列可以增強子的方式遠距離調控。
（5）調控應答元件
受同一機制控制的基因有轉錄因子識別的類似的啟動子元件，使基因應答此類因子的元件稱應答元件，如熱激應答元件、糖皮質激素應答元件、血清應答元件等。
應答元件含有保守序列，不同基因中的應答元件拷貝數很接近，但不完全相同。應答元件可位于啟動子內，也可位于增強子內。基因受識別啟動子或增強子中序列的特定蛋白質調控，這種特定蛋白質起轉錄因子的作用，是RNA聚合酶啟動轉錄所必需的。
3．反式作用因子家族與其DNA結合結構域
同一類序列特異性調節因子一般由多基因家族編碼特定的蛋白質結構，與具有保守性、序列相關的一組應答元件相結合。這些既有蛋白質結構同源性，又能結合相應特定序列的蛋白質稱反式作用因子家族。反式作用因子序列中的基序都與DNA結合，基序通常很短，僅為蛋白質結構中的一部分。
（1）類固醇受體：是一組功能相關的蛋白質，每個受體都經與特定的類固醇結合而得到激活。
（2）鋅指結構：鋅指結構基序含一個DNA結構域。
（3）螺旋-轉折-螺旋：一個螺旋位于DNA大溝內，另一個位于所穿過程DNA的一角。
（4）螺旋-環-螺旋：螺旋具有兩親性，一側為疏水面，另一側為親水面。以二聚體形式與DNA結合，結合部位為堿性區。
（5）、亮氨酸拉鏈：以二聚體形式與DNA結合。
可誘導的轉錄因子的調控方式：
（1）、合成轉錄因子：這種轉錄因子是組織特異性因子，可在特定細胞內合成。
（2）、修飾：一種因子的活性可通過修飾直接控制。
（3）、結合配基：一個因子的活性可通過結合配基而進行激活或抑制。
（4）、切割釋放出轉錄因子：蛋白質被切割形成轉錄因子的活性形式。
（5）、抑制劑釋放：轉錄因子在細胞內有時被抑制劑抑制。
（6）、與不同伴侶形成二聚體：轉錄因子有兩個伴侶分子，無活性的伴侶分子可使它失活。
4．鋅指結構——一種DNA結合結構域
鋅指結構中保守氨基酸的小基團與鋅離子結合形成蛋白質中相對獨立的結構域。
鋅指蛋白和類固醇受體具有鋅指基序。
（1）、鋅指蛋白：其基序根據鋅結合位點凸出的氨基酸環命名，如Cys2/His2鋅指。鋅位于保守的Cys和His殘基形成的四面體結構中，鋅指本身約含23個氨基酸，鋅指間通常有7-8個氨基酸。鋅指結構通常串聯重復排列在一起，有多個鋅指存在，鋅指的數目不等。
鋅指與DNA結合時，每個鋅指的C-端形成α-螺旋與DNA結合，N-端形成β-折疊，α-螺旋伸展進入DNA大溝，每個螺旋與DNA形成兩個基序特異性接觸，C-端的非保守性氨基酸負責識別特異的結合位點。
（2）、類固醇受體
類固醇受體鋅指結構為Cys2/Cys2鋅指，此類蛋白質中鋅指是不重要的，DNA的結合位點較短，呈回文結構。此鋅指結構中每個Cys四面體中央都有一個鋅原子，兩個鋅指結構形成α-螺旋，再折疊成一個大球形結構域。α-螺旋的芳香側鏈與連接兩個螺旋的β-折疊一起形成疏水中心。螺旋的N-端與DNA大溝接觸。
5．mRNA前體的選擇性剪接
真核細胞中一個基因的mRNA前體分子中某個內含子5’的供點在特定條件下與另一個內含子的3’受點進行剪接，從而同時刪除兩個內含子及其中間全部外顯子或內含子，這種按不同方式對mRNA進行的剪接稱選擇性剪接。
來自一個基因的mRNA前體因選擇性剪接而產生多中mRNA，翻譯出不同的蛋白質或組成一組相似的蛋白質家族。
選擇性剪接的方式可因mRNA前體的外顯子或內含子DNA序列中發生突變、缺失，影響5’、3’剪接點的數目和位置。
在錐蟲、線蟲及植物的葉綠體中還發生反式剪接，這種剪接發生在兩個RNA分子之間，以兩個不同來源的RNA分子前體為底物，經過剪接在成熟的mRNA非翻譯部分5’端拼接一小段剪接前導序列的RNA片段，這些片段并不存在于相應的編碼基因前面，而由其他DNA鏈轉錄而來。
6．RNA編輯
是在RNA分子上出現的一種修飾現象，主要指mRNA在轉錄后因插入、缺失或核苷酸的替換改變了DNA模板來源的遺傳信息，從而翻譯出氨基酸序列不同的多種蛋白質。
RNA編輯的機制主要包括核苷酸的替換，如C-U替換、A-I替換、讀碼框架的改變、向導RNA等。
7．mRNA穩定性的調控
真核生物mRNA的穩定性取決于分子內本身的結構特征、轉錄后修飾和所形成的RNP中蛋白質的種類。
真核生物mRNA比原核生物穩定，其核細胞中持家基因的mRNA的壽命較長，有些蛋白質的mRNA壽命較短。
mRNA壽命的延長增加了細胞內某種mRNA的有效濃度，提高了蛋白質合成的速度，這種翻譯水平的調控方式稱翻譯擴增。
8．翻譯的調控
翻譯因子的磷酸化調控、酵母mRNA翻譯的調控、轉鐵蛋白mRNA翻譯的調控。

第四講基因工程的原理
基因工程是指在體外按既定的目的和方案，將一目的基因片段與載體結合，構成DNA重組體，然后引入受體細胞，隨細胞繁殖而擴增，同時也可進行基因表達，產生特定的基因產物或新性狀的遺傳物質的技術。
基因工程又稱遺傳工程、DNA重組技術、DNA克隆或分子克隆技術。
一、工具酶
基因工程中應用的一些酶類稱工具酶，如限制性內切核酸酶、DNA連接酶、DNA聚合酶I、堿性磷酸酶、S1核酸酶、逆轉錄酶、末端轉移酶、T4多核苷酸激酶。
1、限制性內切核酸酶
是一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，限于切割其序列之間的鍵的核酸內切酶，主要發現于微生物中。
根據限制酶的結構，所需輔助因子及裂解DNA方式的不同，將其分為三型，用I、II、III表示。
（1）、限制酶的特性
三型限制酶都能切割雙連DNA，有特定的識別序列和切割位點，催化反應都需Mg++參與等共同特性。
I、III型酶兼具限制和修飾兩種特性，I型酶的識別位點與切割位點不一致。I、III型已很少應用。目前使用的主要是II型酶。
1）、識別特異性
a、識別序列具有縱軸對稱結構或稱回文序列，如EcoR I的識別序列。
酶的識別序列長度為4-6個核苷酸。四核苷酸識別序列的限制酶在DNA鏈上的切點多，產生片段數目多，長度短，酶的特異性較低；六核苷酸識別序列的限制酶在DNA上的切點少，酶的特異性強。
2）、第二活性
在非標準反應條件下，某些酶能切割與其特異性識別序列類似的序列，這種現象叫限制酶的第二活性，也叫星號活性。具有星號活性的酶常在該酶名稱前加以星號（*）表示。
3）、切割位點及酶切片段的末端結構
限制酶切割的靶位點位于識別位點內或附近。切割時水解3’-5’-磷酸二酯鍵的3’方向的磷酸二酯鍵，產物的5’為磷酸單酯基團，3’為游離-OH。
切割后能形成良種末端，平頭末端和粘性末端。在對稱軸上切斷產生平頭末端，在對稱軸左右對稱點交錯切割產生粘性末端。粘性末端有5’粘性末端和3’粘性末端兩種。從5’端切產生5’粘性末端，從3’端切產生3’粘性末端。
有些酶有相同的識別序列，但有不同的切割位點；有些酶識別序列和切割位點都相同；有些酶有不同的識別序列，但切割后產生相同的粘性末端。
能產生相同粘性末端，而識別特異性不同的限制酶稱同尾酶。
4）、識別序列的甲基化與限制酶活性
甲基化酶能使特異識別序列甲基化，保護該序列不被相應限制酶切割。
（2）、限制酶切圖譜測定
限制酶切圖譜稱DNA物理圖譜，是指某種DNA分子的限制酶切位點數目、片段長度和排列順序的圖譜。
常用的測定方法是部分酶解法和雙酶水解法。
A、部分酶解法
選用某種限制酶將DNA分子完全水解，然后用電泳的方法測定完全酶解后片段的數目和整個片段的分子量。再用同一種酶對此DNA進行酶切，測定酶解片段的分子量。將酶切片段的分子量與完全酶解片段的分子量進行比較，排列出各片段的排列順序及酶切位點。如用Alu1完全水解1030bp的線性DNA分子，完全水解時切成750、150、80、50bp四個片段；部分酶切時得到800、2230、130bp三個片段，然后將這些片段重疊比較，推斷出完全酶解四個片段的順序為150-80-50-750。
B、雙酶水解法
選用兩種限制酶分別對DNA分子進行完全水解，電泳分離求出各片段的分子量，然后再用這兩種酶同時對此DNA分子進行完全水解，電泳分離后求出其分子量，分析兩次結果的重疊情況，畫出酶切圖譜。
2、DNA連接酶
DNA連接酶催化相鄰的5’-磷酸基和3’-OH間形成磷酸二酯鍵，使雙鏈DNA單鏈缺口封合。
主要使用的有E.coli連接酶、T4噬菌體DNA連接酶，即T4連接酶。E.coli連接酶可實現粘接，T4連接酶可進行粘接和平接。
3、堿性磷酸酶
催化DNA和RNA 5’-磷酸基水解，產生5’-OH末端。目前使用的有兩種：BAP和CIP，BAP耐熱，CIP特異性強。
4、DNA聚合酶I Klenow片段
Klenow片段是DNA聚合酶I羧基端大片段，具有DNA聚合酶和3’到5’外切酶活性，主要用于平端連接。
二、基因工程基本過程
包括目的基因的制備、基因載體的選擇、DNA重組、DNA重組體的轉化、重組體的篩選和鑒定、外源基因的表達等。
1、目的基因的制備
目的基因可以是含基因的DNA片段，也可以是不含多余成分的純基因。
（1）、直接從染色體中分離
先分離細胞基因組DNA，然后進行特異性的限制酶解或非特異性的隨機切斷。隨機切斷包括機械的、化學的及非特異性的酶降解。
（2）、人工合成
小分子多肽或蛋白質基因直接用化學合成即可制備，大分子蛋白質基因先合成特定的序列片段，再通過DNA連接酶催化連接。
（3）、逆轉錄合成cDNA
從mRNA到cDNA，對未知基因可先用此方法建立cDNA文庫，再篩選目的基因。
建立cDNA文庫的主要步驟包括：提取總RNA、分離mRNA并分級富集、逆轉錄合成第一鏈cDNA，再用Klenow片段合成第二鏈，得到雙連DNA，連接于載體中并轉化。
在分子克隆中cDNA文庫比基因文庫更有用。
（4）、構建基因文庫，釣取目的基因
基因文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆體。
構建基因文庫時一般先建大片段的基因文庫，再將已克隆的大片段剪切為小片段，然后再進行亞克隆。
（5）、聚合酶鏈反應制備特定基因
2、DNA重組
指外源DNA片段與載體DNA連接的過程。
DNA分子間連接的原則：
A、實驗步驟簡單易行；
B、連接點能被限制酶重新切割而便于回收插入片段；
C、有利于重組，避免載體自身環化；
D、對復制表達過程無干擾。
（1）、粘性末端連接
DNA分子的粘性末端有互補粘性末端和非互補粘性末端。互補粘性末端可直接進行連接，連接前用磷酸酯酶將載體的5’-端去磷酸化以減少載體的自身環化；非互補的粘性末端不能直接連接，經修飾成平頭末端或部分平頭末端，再進行連接。
（2）、平端連接
平端連接可用T4連接酶直接進行連接，連接后可產生一個新的酶切位點而有利于重組子的篩選鑒定。但其連接效率較低，常對平頭末端進行改造，進行同聚物加尾，加上衍或接頭再進行連接。
（3）、定向克隆
使外源DNA按既定方向插入載體DNA分子中的過程叫定向克隆。
一般是利用外源DNA分子和載體DNA末端兩種形式。一種是兩端為非同源的互補粘性末端，另一種是一側為互補粘性末端，一側為平齊末端。
定向克隆能有效防止載體自身環化，提高連接效率。
（4）、人工接頭連接
A、連接子：人工合成兩條完全互補的寡聚脫氧核糖核苷酸，長8-12bp，內有一限制酶位點，與外源DNA片段連接后用限制酶產生粘性末端，再與同一限制酶分割后的載體連接。適用于平頭末端的改造和連接。
B、適配子：是一條人工合成的寡聚脫氧核糖核苷酸，與另一適配子互補配對形成雙鏈后具有突出的某種粘性末端，與外源DNA連接后產生粘性末端，再與載體連接。
（5）、多聚核苷酸連接
又叫同聚物加尾。在外源DNA和載體DNA分子中，分別加上多聚脫氧腺苷或多聚脫氧胸苷，根據dA/dT、dC/dG互補在連接酶作用下連接起來。
3、將DNA重組體導入宿主細胞
將質粒或重組質粒導入宿主細胞的過程叫轉化；以噬菌體、病毒為載體構建的重組體導入細胞的過程叫轉染；以噬菌體為媒介將外源導入細菌的過程叫轉導。
不同的宿主，轉移DNA的方法不同：E.coli：用CaCl2處理或電激法導入；酵母：原生質體或乙酸鋰法轉化；動物細胞：磷酸鈣、DEAE、葡聚糖、原生質體、電穿孔法、顯微注射法等。
（1）、用CaCl2處理進行轉化
受體細胞應具有的條件：a、接受外源DNA的能力；b、限制酶缺陷型；c、重組缺陷型；d、使外源DNA復制；e、表達重組子提供的表型；f、非培養條件下難以生存。
轉化的過程包括：用CaCl2處理E.coli，將重組體導入E.coli兩步。
（2）、λDNA的體外包裝
體外包裝是指離體條件下將提取的包裝蛋白與帶COS位點的DNA混合產生噬菌體的過程。
λ噬菌體的包裝是指λ噬菌體未成熟為感染顆粒時，其頭部蛋白先組裝成一個中空的頭部前體，然后λDNA塞入其中，形成λ噬菌體基因組文庫。
λ噬菌體的體外包裝技術常用于構建cDNA文庫和真核基因文庫。
4、DNA重組體的篩選和鑒定
從轉化的細胞中篩選出含重組體的細胞，并鑒定重組體的正確性是分子克隆的最后一道工序。
（1）、根據重組體的表型進行篩選（又叫遺傳檢測法）
A、利用載體提供的表型篩選
分子克隆載體攜帶的遺傳標志包括抗藥性標志、營養標志、報道基因標志等。
①利用基因插入失活是常用的篩選方法，當抗生素性基因前有一類調控序列時，可用插入該序列外源片段進行插入表達篩選。
②利用β-半乳糖苷酶顯色反應進行篩選。
③利用病毒載體的標志基因進行篩選。
④用報道基因與哺乳動物啟動子融合，測定基因表達和轉染效率。
B、利用插入序列提供表型特征進行篩選
外源基因能對宿主細胞所具有的突變發生體內互補體反應，使轉化子表現外源序列中基因編碼的表型特征。
（2）、檢測目的基因或相應的基因產物
A、核酸雜交
是根據同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基互補原則形成雙鏈，其中一條鏈為探針，用于檢測未知核酸片段。
①核酸雜交可分為DNA：RNA雜交；DNA：DNA雜交。
②檢測DNA用Southern雜交，檢測RNA用Northern雜交。
③雜交方法有膜上印跡雜交、斑點雜交、菌落原位雜交等。
④雜交常用的支持物有：硝酸纖維薄膜、尼龍膜、化學活化膜、濾紙等。
⑤雜交探針有基因組探針、cDNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針等。
⑥探針的標記分為放射性標記和非放射性標記。放射性標記同位素有32P、3H、35S等；非放射性標記有生物素、地高辛、光敏生物素、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等。
⑦標記方法有切口平移法、隨機引物法、化學交聯法等。
⑧把待檢核酸轉移到支持物上的方法有毛細管法（印跡法）、電轉移法、真空轉移法等。
B、利用免疫學方法篩選
免疫沉淀、酶聯免疫吸附、固相放射免疫、免疫熒光抗體、Western雜交等。
Western雜交是將電泳分離后的蛋白質轉移到硝酸纖維薄膜后，先用目的基因產物的抗體與之反應，再用標記的抗體檢測。
C、翻譯法篩選
影響特定mRNA在體外翻譯體系中的翻譯來篩選的方法分為阻斷翻譯雜交法和釋放翻譯雜交法。
a、阻斷翻譯雜交法
用轉化菌落提取重組DNA，經變性后與未分級分離的mRNA雜交，回收核酸進行體外翻譯，通過電泳與未經雜交mRNA體外翻譯產物比較，這樣目的基因編碼的蛋白質由于翻譯被抑制而篩選。
b、雜交釋放翻譯法
先將克隆DNA結合于硝酸纖維素濾膜上，再與未分級的mRNA或總RNA雜交，洗脫結合RNA進行體外翻譯，用電泳和放射后自顯影分析鑒定翻譯產物。
D、物理篩選法
重組DNA與載體DNA電泳比較、R-環檢測、限制酶切圖譜法等。
三、基因載體的選擇
載體是攜帶外源DNA片段進入宿主細胞進行擴增和表達的工具，其本質是DNA。常用的載體有質粒、噬菌體和病毒等。
1、質粒
質粒是染色體外能自主復制的雙鏈閉環DNA分子。常用的質粒是來自E.coli 經過改造的質粒，如pBR322、pUC系列、pSP系列、pGEM系列等。
質粒一般克隆較小的外源DNA片段，用于基因工程的質粒應具備的條件：
①能高效地獨立自主復制：質粒復制與宿主細胞的繁殖無關，在細菌染色體 DNA停止復制時，質粒仍可繼續復制。
②有可供選擇的標志，最好是雙重標志：常用的標志有氨芐青霉素抗性基因，四環素抗性基因和E.coli的lac Z基因等。
③同一種限制酶只有一個切點，在復制子以外的適當部位，便于外源基因的插入。酶切位點最好位于篩選標志基因內部。
④分子量盡可能小，拷貝數多，一般在5kb左右，質粒較小，較穩定。
2、λ噬菌體
λ噬菌體是感染細菌的病毒。基因組是雙鏈線性DNA，兩端各有一個單鏈互補粘性末端，稱cos位點。進入宿主細胞后粘性末端互補結合，形成環狀DNA分子。
野生型λ噬菌體的基因組復雜，限制酶切位點多，不宜做基因載體。目前使用的是對其進行改造后構建的載體；一類是插入型載體，只有一個酶切位點，如λgt系列；另一類是替換型載體，有兩個酶切位點，如EMBL3和EMBL4。
λgt系列常用于構建cDNA文庫，EMBL系列常用于構建DNA文庫。
3、粘粒
是一種特殊的質粒。在E.coli中以雙鏈環形存在，含有ampr抗藥性標志和復制起始點，有一個或多個酶切位點，具有cos位點。
4、M13噬菌體
是一種絲狀單鏈噬菌體，在E.coli中以雙鏈復制型存在。
M13噬菌體的特性：（1）、可包裝大片段外源DNA；（2）、感染細菌后，復制環狀單鏈DNA，經包裝形成噬菌體顆粒，分泌到細胞外不產生溶菌。
改造后的M13mp系列特點：（1）、在M13基因4、2之間的間隔區可供外源DNA插入；（2）、有lac調控元件及lac Z作為選擇標志；（3）、在lac Z氨基末端部位上連一個多位點接頭，供克隆用。
5、動物病毒載體
上述4中載體：質粒、λ噬菌體、粘粒、M13噬菌體，只適合在原核生物中表達，不能在真核生物細胞中表達。用于真核生物基因表達的載體有猴病毒40（SV40），人類朊病毒，牛乳頭狀瘤病毒、逆轉錄病毒、疫苗病毒、昆蟲桿狀病毒等。
6、酵母質粒載體
目前應用的是酵母人工染色體構建的載體YAC系統，該載體可直接克隆大片段DNA，基因組包括端粒、復制起始點、篩選標志、核心序列及限制酶切位點。
7、載體功能分類
可分為克隆載體、穿梭載體和表達載體。
（1）、克隆載體
以繁殖外源DNA片段為目的，一般具有自我復制、克隆位點、篩選標志、分子量小、拷貝數多等特點。
（2）、穿梭載體
又稱雙宿主載體，可在兩種不同宿主中復制。用于原核和真核細胞間的遺傳物質轉移。由原核序列和真核序列兩部分組成，原核序列便于在E.coli中復制擴增；真核序列用于轉染目的基因的真核細胞的篩選，并保證基因在真核細胞中表達。
（3）、表達載體
用來將克隆的外源基因在宿主細胞內表達蛋白質的。根據產生的蛋白質不同又分為融合型載體和非融合型載體。
四、基因表達
1、真核基因在E.coli中的表達
基因表達系統有原核表達系統和真核表達系統。目前廣泛應用的是原核表達系統。
基因在原核表達系統表達應注意的問題：
（1）、要構建一個合適的或高效表達載體
原核表達載體的要求：
①有一個強的啟動子及其兩側的調控序列；
②有SD序列及SD序列與起始密碼子之間要有合適的距離；
③在克隆基因與啟動子之間有正確的閱讀框架；
④外源基因下游加入不依賴ρ因子的轉錄終止區。
（2）、編碼基因要完整，沒有插入序列；
（3）、將真核基因克隆到原核基因中，以保證產物表達的穩定性；
（4）、克隆基因中保留信號肽序列，使表達產物自細菌分泌到溶液中，有利于產物的分離純化。
2、真核基因在哺乳動物細胞中的表達
由于在原核細胞中真核基因不能進行內含子的自我剪接，表達的蛋白質不能進行翻譯后加工，不能進行正確折疊，使表達產物量少，活性低，因此目前傾向于用哺乳動物細胞表達系統表達大部分基因。
哺乳動物細胞表達真核基因應注意的問題：
（1）、根據研究目的選擇合適的載體-宿主表達系統。
哺乳動物表達系統分為瞬時與穩定表達系統兩類。瞬時表達系統用于根據產物活性來證實分離基因，從cDNA文庫中篩選基因，誘變對蛋白質生物活性與功能的影響的分析等研究；穩定表達系統用于大量生產蛋白質產品。
（2）、選擇合適的細胞系
不同的培養細胞系攝取和表達外源基因的能力相差非常大。同一基因在一種細胞系上有效，但在另一種細胞系中可能完全不表達。
（3）、外源基因
基因一般來自cDNA克隆或基因組。構建cDNA庫時常引入輔助序列，基因表達是要去掉這些額外序列；基因組DNA不一定含有表達所需的調控序列，需要轉換啟動子或增強子；真核基因轉錄的起始密碼子必須是轉錄物中的第一個起始密碼子。

基因一般來自克隆或基因。