PRRSV感染豬體內多殺性巴氏桿菌的分離與血清型鑒定

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   陳申秒，李 郁，謝玉潔，王桂軍，魏建忠

   自2006年入夏以來，我國南方地區許多豬場發生了以高熱、呼吸困難、皮膚發紅為主要特征的流行性疾病—豬“高熱病”，具有高發病率和高死亡率，給養豬業造成了嚴重的經濟損失。為弄清其病因，各地相關學者對此進行了大量的研究，最后證實豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)變異株是本次豬高熱病的主要病原。PRRSV感染能嚴重損害機體的免疫器官，造成免疫抑制，從而繼發其他傳染病。臨床研究發現，PRRSV單獨感染引起的病理變化多為間質性肺炎，然而，發生高熱病的豬表現的病變情況則較為復雜和嚴重，表明PRRSV與其他病原體(如豬圓環病毒2型、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌等)的繼發和混合感染是引致豬“高熱病”發生的原因所在。
安徽省許多地方也同期發生了疫情較為嚴重的豬“高熱病”，為研究和分析病豬由PRRSV引起的的繼發或混合感染情況，本試驗應用常規方法和PCR技術從安徽省多個豬場PRRSV檢測陽性的病料中進行多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)的分離鑒定，并確定其血清型，從而為安徽省豬“高熱病”的綜合防控提供可靠的理論依據和技術支撐。
1材料與方法
1．1試驗材料
1．1．1病料
采集安徽肥西、廬江、肥東、定遠、桐城五個地區(代號為FX、LJ、FD、DY、TC)豬場病料(肺臟)共計49份，經RT．PCR，PRRSV檢測均為陽性。
1．1．2參考菌株
多殺性巴氏桿菌(A型)由本實驗室保存，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌購自中國科學院微生物所。
1．1．3主要試劑
5％胎牛血清肉湯、普通瓊脂、鮮血瓊脂等培養基自制；葡萄糖等細菌微量生化反應管以及靛基質、硝酸鹽還原試劑盒均購自杭州微生物試劑有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、TaqDNA聚合酶、MgCl2、dNTP、DL2000DNA Marker等購自上海生工生物工程技術有限公司。
1．1．4 引物
根據Townsend等報道合成Pm種與型特異性引物，由上海生工生物工程技術有限公司合成，見表1。

1．2細菌分離培養
無菌采取病料，接種于5％胎牛血清肉湯，37 ℃振蕩培養l8～24 h后，分別轉種到普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板和麥康凱培養基，37℃培養24 h，挑取可疑菌落染色、鏡檢。
1．3生化試驗
將分離菌純化后，接種于上述各種生化培養基中(用前加入5％胎牛血清、0．01％NAD)，37℃培養24～48 h。
1．4細菌DNA模板的制備
將分離純化菌接種到5％胎牛血清肉湯中，37℃、l00 r／min振蕩培養24 h，取5μL菌液直接作為DNA模板。
1．5 Pm種和型的PCR鑒定
反應體系：總體積25μL，其中10×PCR Buffer 2．5μL，MgCl2(25 mmol/L)1．5μL，Pml、Pm2、PmAl、PmA2(10 pmoL／L)各1 μL，10 mmol／LdNTPs 0．5μL，ddH20 13μL，DNA模板5μL。反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 S，55℃退火30 S，72℃延伸45 S，共35個循環；72℃延伸10min。
1．6 PCR產物分析
取5μ L PCR產物經1％瓊脂糖凝膠(含0．5μl/mL溴化乙錠)在80 V電壓下電泳40 min，凝膠成像儀上觀察、拍照結果。
1．7金黃色葡萄球菌抑菌試驗
金黃色葡萄球菌在生長過程中的代謝產物之一是透明質酸酶，A型Pm的莢膜成分對其敏感，可產生生長抑制現象。將分離鑒定的Pm以10 mm的間隔劃線接種到鮮血瓊脂培養基，然后以金黃色葡萄球菌垂直劃線，37℃培養24 h，觀察金黃色葡萄球菌接種線周圍Pm是否發生菌落抑制或消失現象。
2 結果
2．1細菌分離培養
在49份PRRSV檢測陽性病料中分離到7株疑似Pm。分離菌在鮮血瓊脂培養基上生長良好，初為透明、邊緣整齊的露珠樣菌落，24 h后為灰白色、圓形、微隆起光滑菌落，不溶血；在麥康凱培養基上不生長，普通瓊脂培養基上生長貧瘠。在加5％胎牛血清的肉湯中振蕩培養12 h出現渾濁。單個菌落革蘭氏染色見陰性小桿菌，5％胎牛血清肉湯培養36～48h后菌液染色可看到莢膜，美藍染色可見兩極濃染。7株分離菌均符合多殺性巴氏桿菌生長特性。
2．2生化試驗
7株分離菌生化試驗結果見表2，均與多殺性巴氏桿菌生化特性相符合。

2．3 Pm種的PCR鑒定
7株分離菌均擴增出大小為457 bp的目的條帶，為多殺性巴氏桿菌。
2．4金黃色葡萄球菌抑菌試驗
在金黃色葡萄球菌接種線周圍，7株Pm周圍均出現明顯生長抑制現象，初步判定為A型Pm。
2．5 Pm型的PCR鑒定
7株Pm均擴增出大小約1 048 bp大小的的目的條帶，屬于A型Pm。
3討論
多殺性巴氏桿菌是豬繁殖與呼吸道綜合征發病過程中主要繼發病原菌之一。在49份PRRSV檢測陽性的病料中，分離到細菌l8株，經鑒定7株為Pm，2株為副豬嗜血桿菌，3株為鏈球菌，其他細菌6株，其中Pm檢出率為l4．3％(7／49)，與副豬嗜血桿菌4．1％(2／49)、鏈球菌6．1％(3／49)的檢測結果相比，Pm分離率最高，顯示安徽省豬“高熱病”的發生與PRRSV引起的繼發或混合感染Pm密切相關。因此，在加強豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟等重大疫病免疫的同時，應增強豬體抵抗力，減少應激，防止細菌繼發感染。
根據莢膜抗原的不同，Pm分為A、B、D、E、F共5個血清型，其中A、B和D型已在豬中發現，從肺炎病例中分離出的最常見血清型是A型。Pijoan從肺臟分離的Pm有87．5％為A型，l2．5％為D型；Robea報道從有肺炎癥狀豬分離的Pm 75％為A型，l3％為D型；李永明等對13株Pm進行莢膜抗原PCR的檢測顯示8株為A型。本次試驗主要是從發病豬的肺臟進行細菌分離，7株Pm均屬于A型，與國內外的研究報道相一致，從而表明A型是當前繼發感染的多殺性巴氏桿菌的主要血清型。由于Pm的各血清型之間多無交叉免疫反應性，因此分析當地流行的Pm血清型對于該病的防治及疫苗的研究具有意義。
目前對豬多殺性巴氏桿菌病的微生物學診斷常采用病變組織的涂片染色鏡檢和病原分離、生化反應及動物試驗等，若要鑒定莢膜抗原型還需用抗血清甚或單克隆抗體進行血清學試驗。在豬多殺性巴氏桿菌病的快速診斷上，常規方法存在著一定的局限性。本試驗同時采用了常規方法和PCR技術進行Pm分離鑒定，其結果相一致。由于PCR技術具有快速、簡便、特異、靈敏的優點，并且可以進行莢膜抗原型的特異性檢測，避免了血清學鑒定的不便，因此在Pm及其血清型的鑒定方面，PCR方法具有實際應用價值。

海棠

在我們的臨床診斷中，伴隨藍耳病的主要還是付豬嗜血桿菌和鏈球菌。

zhangxinlq

在臨床上繼發感染后控制難度比較大