O78型鴨大腸桿菌的分離鑒定及免疫試驗

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取菌種，用滅菌接種環致密劃線于瓊脂平板表面，用無菌鑷子將各種抗菌藥物圓紙片分別貼于培養基表面，各片距離要相等37℃培養24小時觀察結果。

1.2.4
血清學鑒定

挑取麥康凱上的菌，以馬丁肉湯擴大培養，121℃滅活30min,用禽源大腸桿菌O型單因子血清進行平板凝集反應。

毒力試驗摘要：2008年從四川某鴨廠發生的以心包炎肝周炎為特征的病鴨群中分離獲得1株革蘭氏陰性桿菌，定名為SC-2008。經分離培養、形態學檢查、生理生化試驗、血清學鑒定、毒力實驗，分離菌株被鑒定為O78型鴨大腸桿菌。用該菌株進行液體培養制備的油乳劑滅活疫苗，可使鴨獲得較好的免疫力，能有效的預防本病的發生。

關鍵詞：鴨大腸桿菌；鑒定；免疫

大腸桿菌可引起鴨敗血性傳染病，病鴨病變特征為心包炎、肝周炎、氣囊炎等，近年隨著規模化養鴨業的不斷發展，鴨大腸桿菌病的發生有越來越嚴重的趨勢，成為目前危害養鴨業最嚴重的傳染病之一。

1材料與方法

1.1材料

培養基：麥康凱和改良馬丁，自制；病鴨來源：四川；生化反應管：杭州微生物試劑有限公司

1.2方法

1.2.1
細菌學檢查

根據臨床癥狀、發病鴨剖檢，主要病理變化有心包炎、肝周炎、膽囊充盈、全身敗血癥。無菌采取該鴨的腦和肝臟，常規處理，在麥康凱和改良馬丁上劃線，放入37℃培養箱培養24h，鏡檢后，挑選單個菌落,繼續劃線培養。挑取麥康凱平板上的單一菌落，按常規方法進行革蘭氏染色。

1.2.2
生化試驗

取細菌的純培養物分別接于微量發酵管，37℃培養24小時，觀察結果。

1.2.3
藥敏試驗

1.2.5

1.2.5.1
半數致死量

將菌液稀釋至16×104CFU, 8×104CFU, 4×104CFU, 2×104CFU, 1×104CFU, 0.5×104CFU和 0.25×104CFU細菌，將19日齡肉鴨隨機分成8組，每組5只，分別于腿部肌肉攻毒1ml/只，生理鹽水設為對照組。

1.2.5.2
哺乳動物接種試驗

	小鼠	豚鼠	兔子
劑量	10億/只	100億/只	1000億/只
注射部位	腹腔	皮下	皮下
體重	30—35g	350—400g	1200—1500g

1.2.5.3
SPF雞接種試驗

取15只21日齡SPF雞，隨機分成三組，將菌液稀釋成2.5×105CFU，1×106CFU，5×106CFU，肌肉注射，1 ml/只。

1.2.6
疫苗制備

1.2.6.1
菌液制備

將細菌接種到液體改良馬丁培養基，于37℃搖床培養7h，活菌計數，將菌液加入4‰的甲醛于37℃滅活24小時，將菌進行無檢、安檢。

1.2.6.1
滅活疫苗的制備

取滅活后檢驗合格的菌液加吐溫-80制成水相，與混合油相一起乳化制備滅活疫苗。

1.2.6.2
疫苗性狀測定

對制備的油乳劑滅活苗進行物理性狀檢驗、劑型試驗、穩定性試驗、有效期測定等。

1.2.6.3
滅活疫苗效力檢驗

用試制的疫苗皮下接種于5日齡健康易感肉鴨40只，0.3ml/只（含一個免疫劑量），于免疫后7d、10d、14d、28d，分別隨機選取10只攻毒，另選10只未免疫做空白對照，攻50倍半數致死量的量，計算保護率。

2結果

2.1
菌體形態

接種麥康凱培養基平板上，37℃培養24小時，肉眼觀察為粉紅色，隆起，表面光滑邊緣整齊的S型菌落。代次間菌落大小，光滑度，隆起度，色澤度，邊緣整齊度肉眼看不出差別。涂片為革蘭氏陰性，兩端鈍圓的桿菌。

2.2
生化試驗

鳥氨酸（+）、甘露糖（+）、甘露醇（+）、木糖（+）、阿拉伯糖（+）、果糖（+）、山梨糖（+）、鼠李糖（+）、半乳糖（+）、棉子糖（+）、麥芽糖（+）、葡萄糖（+）、乳糖（+）、山梨醇（+）、水楊素（—）、七葉苷（—）、枸櫞酸（—）、硫化氫（—）、蔗糖（—）、木糖醇（—）、衛茅醇（—）、肌醇（—）、側金盞（—）、明膠22℃（—）、糊精（—）、尿素（—）。從結果上看100%符合大腸桿菌的生化特性。

2.3
藥敏試驗

共做了38種藥敏片，主要是氨基糖苷類敏感，其余都有或多或少的耐藥性

有效果的主要為：

藥物種類	多粘菌素B	頭孢曲松	磷霉素	卡那霉素	新霉素
抑菌圈大小	1.1cm	2.0cm	1.65 cm	1.7cm	1.9cm
敏感度	中度敏感	中度敏感	敏感	中度敏感	敏感

2.4血清學鑒定

O78血清凝集為陽性

2.5動物攻毒

2.5.1半數致死量

經計算：LD50=0.37萬/只，MLD=4萬/只

2.5.2哺乳動物接種試驗

攻毒16h小白鼠和豚鼠死亡，40h兔子死亡，兔子在攻毒16h體溫平均升高2℃，對照健存。均出現皮下出血，肝臟出血，腸道出血，水腫，膠凍樣，心臟冠狀出血，肺臟出血，胰臟出血，胃出血。取肝臟和心臟細菌分離，均分出大腸桿菌。

2.5.3 SPF雞接種試驗

48小時均出現癥狀，注射1×106CFU，5×106CFU，雞在96小時發生死亡，對照正常，剖檢均有腿部肌肉出血，心包炎，肝周炎，腸道出血，肺臟出血，氣囊混濁膽囊充盈，取肝臟和心臟細菌分離，均分出大腸桿菌。

2.6疫苗制備

2.6.1疫苗性狀測定

該油苗為乳白色乳劑,劑型為油包水型。以3 000 r/min離心15 min,疫苗不出現分層現象；在

37℃左右條件下放置21 d，不破乳；2~8℃及室溫存放6個月，基本不出現分層現象。保存期測定，2~8℃冷藏保存，有效期為1年；粘度測定時間為3.6 s，適于注射。

2.6.2免疫產生期和免疫持續期試驗

免疫7d保護率即達到100%保護，對照鴨全部死亡。到28d保護率未發生變化。

3討論

3.1對分離的細菌進行形態觀察、生化試驗及血清學鑒定為O78型大腸桿菌，據報道，與禽病有關的大腸桿菌最常見的是O1、O2、O35、O78等[1]。此株菌可用于制備流行株的疫苗。

3.2分離出大腸桿菌O78對鴨、雞、小白鼠、豚鼠和兔子具有較高的毒力，在生物學上應引起重視。

3.3由于大腸桿菌帶有可傳導的抗藥性質粒和菌株[2]，加上大腸桿菌病防治中，抗生素的普遍使用，使得大腸桿菌的耐藥譜越來越寬，，防治效果越來越差；此外，藥物防治的成本不斷提高，并造成鴨胴體內藥物殘留而影響公共衛生[3]。因此應用藥物治療大腸桿菌病有一定的局限性。從結果可看出分離株的免疫原性很好，本試驗制備的油乳劑滅活疫苗是針對某些地區的疫情而研制生產的，因而在使用過程中能在早期很快地形成群體免疫，具有針對性強、免疫期長的特點，且在使用時不存在散毒問題，安全、可靠。

3.4大腸桿菌是條件性致病菌，普遍存在于鴨群中，當環境改變和抵抗力下降時容易發生此病。因此建議根據當地流行株進行針對性免疫，平時還需要加強環境管理，此為長期預防大腸桿菌病的關鍵。

參考文獻：

[1]
宋立,寧易寶,張秀英,等.中國不同地區禽大腸桿菌血清型分布和耐藥性比較研究[J].中國農業科學,2005,38(7):1466-1473.

[2]
Van Den Bogaard , A E , N London , et al . Antibiotic resistance of faecal Escherichia coli in poultry , farmers and poultry slaughterers[J] . J Antimicrob Chermother , 2001 , 47 : 763-771.

[3]
Caya F , J M Fairbrother , L Lessard , et al . Characterization of the risk to human health of pathogenic Escherichia coli isolates from chicken carcasses [J] . J Food Prot , 1999 ,62 : 741-746.

[4] 李玲,汪銘書,程安春,等.雛鴨致病性大腸桿菌的分離鑒定藥敏試驗及耐藥分析[J].中國獸醫雜志,2007,43(12):34-36.

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