葉黃素的測定方法研究

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[p=30, 2, center]　[size=2]　[b]葉黃素的測定方法研究[/b][/size][/p][p=30, 2, center][b]　　趙小陽 田河山[/b][/p]
　　葉黃素(Lutein)又名“植物黃體素”，分子式C40H56O2，分子量為568.88,屬類胡蘿卜素活性物質,因為工藝太復雜,人工合成單一異構體的葉黃素至今尚未成功,目前只有萬壽菊花朵等天然植物中提取的葉黃素才含具有抗氧化作用的活性物質,作為飼料添加劑著色劑主要添加到肉雞、蛋雞、鴨、魚飼料中，可使動物皮膚脂肪變黃，蛋心變紅，使商品肉類蛋類品質提升，營養增加。工業色素是許多國家禁止使用的色素，在飼料中添加工業色素(黃色化學合成染料)，會對人體造成危害，食品安全的需要對飼料添加劑的安全性提出了更高的標準，本文主要介紹利用高效液相色譜法和分光光度法測定葉黃素的含量，其中高效液相色譜法可鑒別其他色素如蘇丹紅、日落黃、檸檬黃等的干擾，適合以植物萬壽菊中脂溶性提取物為原料，經皂化后，制成水劑或采用淀粉、玉米芯粉、白炭黑等輔料，有效成分主要是葉黃素和它的同分異構體玉米黃質，也有少量的其它類胡蘿卜素和臘質，在飼料工業中作為著色劑類飼料添加劑葉黃素的檢測。
　　1. 實驗方法
　　除特殊說明外，所用試劑均為分析純，標準溶液和雜質溶液的制備應符合GB/T602和GB/T603的規定。
　　1.1 試劑和溶液
　　1.1.1 正己烷：色譜純。
　　1.1.2 乙酸乙酯：色譜純。
　　1.1.3 正己烷。
　　1.1.4 無水乙醇。
　　1.1.5 丙酮。
　　1.1.6 甲苯。
　　1.1.7 提取劑:正己烷+乙醇+丙酮+甲苯=10+6+7+7(V+V+V+V)。
　　1.2 儀器和設備
　　實驗室常用設備;
　　1.2.1 超聲波水浴。
　　1.2.2 紫外分光光度計。
　　1.2.3 石英比色皿(1cm)。
　　1.2.4 高效液相色譜儀，帶紫外可調波長檢測器(或二極管矩陣檢測器)。
　　1.3 鑒別試驗
　　1.3.1 原理
　　葉黃素含量以總類胡蘿卜素含量表示，試樣中總類胡蘿卜素經混合溶劑提取后，注入正相色譜柱上，用流動相洗脫，分離出葉黃素和玉米黃質，其色譜峰的分離度為3.06-3.09,葉黃素含量應在70%以上，玉米黃質含量在10%以上，并通過峰面積比例測知其相對含量。
　　1.3.2 試樣溶液的制備
　　根據產品含量，稱取試樣約0.15g～0.2g，(精確至0.0002g)，置于100mL棕色容量瓶中，加提取劑(1.1.7)約80mL，在超聲波水浴中加熱超聲提取20min，冷卻至室溫，用提取劑(1.1.7) 定容至刻度，混勻，過濾,用移液管準確移取1mL濾液到10mL容量瓶中,用氮氣吹干,用流動相稀釋至刻度,混勻,溶液過0.45μm濾膜，供高效液相色譜儀分析。
　　1.3.3 色譜條件：
　　固定相：硅膠柱：內徑4.6mm，長250mm，粒度3µm。
　　流動相：正己烷+乙酸乙脂=70+30(V+V)，超聲脫氣。
　　流速： 1.5mL/min。
　　檢測器：紫外可調波長檢測器(或二極管矩陣檢測器)，檢測波長446nm或474nm。
　　進樣量：20µL。
　　1.3.4 試樣測定：將試樣分析液(1.3.2),按上述色譜條件進行進樣分析,得到葉黃素和玉米黃質，色譜峰可參見圖1。
　　1.3.5 結果計算：
　　葉黃素(%)=總類胡蘿卜素量×葉黃素的峰面積% …………………(1)
　　玉米黃質(%)=總類胡蘿卜素量×玉米黃質的峰面積% ……………(2)
　　1.4 葉黃素含量的測定
　　1.4.1 原理
　　葉黃素在波長446nm±1nm處有最大吸收，可根據該波長處測定吸收度和標準百分吸光系數( )計算其含量。
　　1.4.2 試樣溶液的制備
　　根據產品含量，稱取試樣約0.15g～0.2g，(精確至0.0002g)，置于100mL棕色容量瓶中，加約80mL無水乙醇(1.1.4)，在超聲波水浴中加熱超聲提取20min，冷卻至室溫，用無水乙醇(1.1.4)定容至刻度，混勻，過濾，用移液管準確移取1mL濾液到10mL容量瓶中，用無水乙醇(1.1.4)稀釋至刻度,混勻。
　　1.4.3 試樣的測定
　　將試樣分析液(1.4.2)置于1cm石英池中,用紫外分光光度計,在波長446nm±1nm處測定吸收度A,以無水乙醇(1.1.4)為空白對照。
　　1.4.4 計算和結果的表示
　　試樣中葉黃素(C40H56O2)(以總類胡蘿卜素計)含量X以質量分數(%)表示，按式(3)計算：
　　X= …………………(3)
　　式中：
　　A—試料(1.4.2)吸收度讀數;
　　1000—試料(1.4.2)稀釋倍數;
　　m—試料質量，單位為克(g);
　　2550—葉黃素百分吸光系數( =2550);
　　平行測定結果用算術平均值表示,保留三位有效數字。
　　1.4.5 重復性
　　同一分析者對同一試樣同時兩次平行測定結果的絕對值之差應不大于0.3%。
　　2. 產品含量檢驗方法的建立
　　2.1 色譜條件的選擇
　　樣品的乙醇溶液用分光光度計測定，以1cm石英比色皿在420～480nm波長范圍內測定試樣溶液的吸收光譜，在445nm±1nm、473nm±1nm的波長處有最大吸收峰，光譜圖見圖一，色譜圖見圖二。
　　圖一:
　　
　　No. nm Abs
　　1 473.50 0.589
　　2 445.00 0.687
　　圖二:
　　
　　葉黃素保留時間：14.801min,玉米黃質保留時間：18.292min。
　　2.2 提取劑的選擇
　　葉黃素含量測定方法采用紫外分光光度法，我們選擇兩種提取劑做比較，參照JECFA(2004)方法中用正己烷+乙醇+丙酮+甲苯=10+6+7+7(V+V+V+V)做樣品提取劑，根據葉黃素易溶于乙醇的性質，用乙醇做樣品提取劑，用分光光度計測定，以1cm石英比色皿在445nm波長處測定試樣溶液的吸收光譜，我們收集不同廠家產品進行測定，對比測定結果見表一。
　　表一 不同提取劑測定結果對比[table]
[tr][td=1,1,205][p=30, 2, center][font=宋體]生產廠家[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]混合溶劑提取（%）[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]無水乙醇提取（%）[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,205][p=30, 2, center][font=宋體]廠家一[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]1.47[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]1.55[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,205][p=30, 2, center][font=宋體]廠家二[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]1.41[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]1.36[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,205][p=30, 2, center][font=宋體]廠家三[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]1.18[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]1.29[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][/tr]
[/table]
　　兩種提取劑測定結果差異不大，考慮到甲苯對人體危害較大,本方法樣品中葉黃素含量的測定采用無水乙醇做提取劑,方法簡單,結果準確。
　　2.3 不同廠家生產的飼料添加劑葉黃素檢驗結果與標示量對比
　　選取不同廠家不同批號的產品,按照本方法確定的實驗條件進行含量的測定，其結果見表二。
　　表二 不同廠家的產品含量檢驗結果與標示量對比[table]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]樣品代號[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]葉黃素含量檢驗結果（%）[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]葉黃素標示量（%）[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]占標示量（%）[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]1[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]1.52[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]1.60[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]95[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]2[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]1.82[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]1.60[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]114[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]3[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]1.36[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]1.50[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]91[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]4[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]2.24[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]2.00[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]112[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]5[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]2.18[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]2.00[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]109[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]6[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]1.38[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]1.50[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]92[/font][/p][/td][/tr]
[/table]
　　以上結果表明, 按照本方法測定樣品含量，均為樣品標示量的90%以上,本方法有較好的準確度。
　　2.4 方法精密度(重復性)
　　選取同一批葉黃素飼料添加劑，按照本方法確定的條件進行重復實驗，制備五份溶液，測試飼料添加劑葉黃素的含量，測定結果見表三。
　　表三 同一樣品重復測定五次結果[table]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]測定次數[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]葉黃素含量(%)[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]1[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]2.35[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]2[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]2.17[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]3[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]2.24[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]4[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]2.19[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]5[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]2.21[/font][/p][/td][/tr]
[/table]
　　對于同一樣品，其變異系數(CV%)為3.2%，本方法有較好的精密度、重復性。
　　2.5 同一分析者對同一試樣同時兩次平行測定結果絕對值之差的確定
　　選擇不同產品做兩次平行測定，測定結果見表四。
　　表四 不同產品兩次平行測定結果絕對值之差[table]
[tr][td=1,1,160][p=30, 2, center][font=宋體]樣品代號[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]葉黃素含量[/font][/p][p=30, 2, center][font=宋體]
[/font][font=宋體]（%）[/font][/p][/td][td=1,1,156][p=30, 2, center][font=宋體]絕對值之差[/font][/p][p=30, 2, left][font=宋體]（%）[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋體]1[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]1.55[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋體]0.03[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]1.52[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋體]2[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]1.99[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋體]0.17[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]1.82[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋體]3[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]1.57[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋體]0.02[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]1.55[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋體]4[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]2.17[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋體]0.07[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]2.24[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋體]5[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]2.56[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋體]0.19[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]2.37[/font][/p][/td][/tr]
[/table]
　　測定結果表明，本方法兩次平行測定結果絕對值之差均小于0.3%,在實驗方法中,將該值定為小于0.3%。
　　實驗證明,本方法有較好的準確度與精密度,方法合理,操作便捷,適合飼料添加劑葉黃
　　素的檢測。
　　趙小陽 國家飼料質量監督檢驗中心(北京)，化學分析高級實驗師。
　　田河山 中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，動物營養研究員

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