發酵豆粕工藝與固體發酵過程監測指標初探

葉赫娜蘭.孤城

摘要：按照工業發酵技術的基本觀點，離開過程控制，發酵工藝就不可能進行，也就談不上可重復性和穩定性。成熟的發酵技術特點就是嚴格的過程控制。而過程控制的實現，需要對過程參數進行選取和有效監測。這些被選定和監測的參數，表現的是微生物群體代謝所體現出的宏觀變化。一般性地被稱作發酵生理參數，以有別于生化參數等細胞水平和亞細胞水平的代謝指標。
沒有參數的發酵過程是不可能實現穩定的。必須克服或部分克服以上困難，提供可靠的生理參數數據，實現發酵豆粕工藝的穩定性。
目前在發酵豆粕一般應用中，文獻可以查到的固體發酵工藝，無一具有過程控制，而實現過程控制是真正工業化的前提。要想實現控制，必須進行發酵生理數據的采集與分析。目前參照液體深層發酵工藝所選用的檢測方法是有效地。
由于參數選取過程中就考慮到工業應用，這些參數具有快速檢測的可能。

關鍵詞：豆粕發酵；檢測；監測指標；過程控制

葉赫娜蘭.孤城

1.豆粕發酵的意義與效果

豆粕是廣泛應用于飼料工業的蛋白源。但是，豆粕本身的某些理化特點，限制了豆粕應用價值的體現。如，抗營養因子的存在，氨基酸的不平衡，結構致密造成的適口性差和消化率偏低等。目前，應用發酵技術處理豆粕，是有效提高豆粕品質的方法之一。

比如，在抗營養因子方面，通過發酵技術，可將目前已知的多種抗營養因子去除。見表1。

項目        優質豆粕        發酵豆粕
胰蛋白酶抑制因子mg/g        10-15        ≤1
植酸mg/g        10.60        --
大豆凝血素mg/g        1.93-7.58        --
不亮寡糖%        5-20        ＜0.9
致甲狀腺腫素1/106        165.59        --
大豆球蛋白mg/g        400        ＜0.02
β-大豆伴球蛋白mg/g        155        ＜0.01
脲酶活性        0.4        0.02
脂肪氧化酶相對活性        98        --

表-1    豆粕發酵前后各指標比較

在發酵過程中還可以產生直接被動物吸收的小肽和其他多種生物活性物質，這對動物的生長十分有利。在發酵過程中產生的呈味物質，對于動物，特別是幼齡動物，具有明顯的誘食效果。并且，由于部分碳水化合物被降解，豆粕致密的結構變得疏松，適口性顯著提高。

葉赫娜蘭.孤城

2.發酵豆粕常見菌種與工藝特點

目前，應用于豆粕發酵的菌株很多。在菌株選擇方面，只要不產生毒素，并且在食品發酵或獸用微生態制劑中應用的菌株，在豆粕發酵中都可能用到。細菌中，乳酸桿菌和芽孢桿菌得到應用。酵母菌中，釀酒酵母和擬內孢酶得到應用。真菌中，曲霉，根霉，木霉，毛霉都得到應用。雖然目前沒有擔子菌等大型真菌用于發酵豆粕的報道，但理論上，由于擔子菌產生高活性的纖維素酶，相對細菌，擔子菌處理豆粕應該具有一定優勢。當然，沒有放線菌用于發酵豆粕的報道。

雖然豆粕發酵中菌株應用較多，但發酵工藝卻具有趨同的傾向。目前常見的工業水平的發酵豆粕，選用工藝一般具有以下幾個特點：

1，        應用固體發酵工藝，而不是液體發酵工藝。
2，        開放式接種，優勢培養或多菌株培養，而不是純培養。
3，        豆粕發酵前的預處理階段一般省略掉消毒過程。

這是由于發酵豆粕大量應用在畜牧行業，所以，低附加值的現實，壓縮豆粕發酵工藝成本所致。固體發酵工藝相對液體發酵工藝，雖然因為水活度的問題，有效率偏低的缺點，但卻節省了烘干或噴干成本，在動力上比較合算。而固體發酵工藝純培養的實現，要比液體發酵工藝困難，也就意味著提高成本，因此在豆粕發酵中選用了優勢培養或混菌培養。由于已經不是純培養工藝，這就為省掉消毒過程，進一步降低動力成本提高了條件。因此，在成本的壓力下，雖然選用菌株有異，但發酵豆粕工藝具有趨同的特點。

整體看來，發酵豆粕技術（含菌種和工藝），是在食品發酵發展或參考食品發酵而來的。由于時間積累的限制，雖然工藝已經有趨于相同的表現，但整體技術水平還處于比較低的狀態。或說，相對于以抗生素為代表的液體深層發酵，尚處于有待發展的初級階段。

成熟工藝或成熟技術的最明顯的特點是工藝的穩定性以及對這種穩定性實現手段的規范性。穩定性的外在表現，是可重復性。除了經濟性，可重復性是衡量某工藝工業化價值的唯一指標。應用目前常見的發酵豆粕工藝，批次差異巨大，可重復性低是不爭的事實。

葉赫娜蘭.孤城

3.限制發酵豆粕工藝成熟的原因是發酵過程控制的缺失
   
按照工業發酵技術的基本觀點，離開過程控制，發酵工藝就不可能進行，也就談不上可重復性和穩定性。成熟的發酵技術特點就是嚴格的過程控制。而過程控制的實現，需要對過程參數進行選取和有效監測。這些被選定和監測的參數，表現的是微生物群體代謝所體現出的宏觀變化。一般性地被稱作發酵生理參數，以有別于生化參數等細胞水平和亞細胞水平的代謝指標。

對于生理參數的選取和大量測定，是實現過程控制的前提。一般常見的生理參數為：pH值，生物量（用菌濃，濕菌體含量，干菌體含量，涂布菌落，細胞量，OD值等來表示。），糖含量，氨基氮含量，可溶性磷含量，目標產物含量，溶氧，尾氣中氧，二氧化碳含量，發酵過程熱量的產生速率（一般通過降溫水流量標示），等等。其中，最常用的為pH值，生物量，糖，氮，磷含量和目標產物含量。真正的數據分析，以實現過程控制，就是以來對這幾個參數的分析與綜合進行的。

但是，雖然各種檢測手段，如，HPLC,GC，電泳，分管光度法，甚至酶聯免疫吸附法等監測技術頻繁應用于豆粕發酵，但豆粕發酵的過程控制還是接近于沒有。原因是這一系列的檢測方法，只不過是在發酵結束后的成品監測中被應用，以證明發酵的效果和必要性的。而并不方便應用在過程監測中。

發酵豆粕，甚至整個固體發酵工藝，相對于液體深層發酵，在發酵過程控制方面，主要存在以下三個差異：

1，        沒有成熟選定的，行業內技術人員統一認可的生理參數，甚至根本沒有任何形式的生理參數及檢測和監測方法。
2，        因為沒有生理參數，也就沒有對生理參數曲線分析水平的過程控制，也就不能真正實現工藝過程的可重復性。
3，        行業中缺乏對生理參數分析，以實現工藝過程穩定的習慣和意識。

造成這些差異的原因可以在兩個方面進行分析。首先，發酵豆粕工藝基本脫胎自食品發酵的固體發酵工藝，而食品固體發酵技術，過程控制和經典發酵不同，是基于經驗而不是基于生理參數的。但食品發酵工藝經歷了數百年經驗積累，由于成本壓力，發酵豆粕技術只繼承了食品工藝的大致過程，而沒法真正延續食品發酵的控制模式，這就使得豆粕發酵技術具有某種程度的先天不足。其次，固體發酵工藝相對液體發酵工藝，所面對的物料理化性質不同。在液體發酵中，所有生理參數是在水溶液里測定的，但在固體發酵中，所面對的物料是固體的。這就為生理參數的選取和測定方法的建立提供了阻力。另一方面，由于在液體發酵中的劇烈攪拌，已經使得任何一點取樣都具有整體意義，而對于固體物料，每一點僅僅代表了當前點的狀況。這就使得單點監測值沒有代表意義。

沒有參數的發酵過程是不可能實現穩定的。必須克服或部分克服以上困難，提供可靠的生理參數數據，實現發酵豆粕工藝的穩定性。

葉赫娜蘭.孤城

4.發酵豆粕工藝生理數據檢測方法與分析方法的建立

一般發酵工業生理參數的選取和監測方法的建立，遵循以下三個原則：

1，        取樣方法簡單，易于獲取或經過簡單處理后，易于獲取具有可以代表整體的普遍性意義的樣本。
2，        檢測方法簡單，最起碼簡單到已經在行業內通用或可以在行業內通用。
這樣就為在行業內工程人員的交流提供可能，也為進一步改進檢測方法提供可能。
3，        相對于準度，更要求具有低散布性，高精度的檢測方法。
在參數選取后，需要真實值以作出最后的結論或幫助作出最后的結論的情況下，準度是一個比較重要的選取檢測方法的依據。但在過程控制中，由于看中的是曲線的發展趨勢，并且經常要對曲線進行數學運算等處理。如積分，微分等等，以發現參數細微變化對宏觀代謝的意義，這就使得精度的意義十分重大。

在固體發酵工藝參數選擇，也應該遵循以上三個原則。雖然固體發酵是面對固體物料，但是，由于一切生命代謝都是在水溶液中進行，固體物料實質上是一個氣，液，故三相的復雜生物體系。這種體系的成分復雜，待測指標含量隨時間差異變化極大，隨著發酵批次的變化和同批次發酵時間的變化，適應性差的檢測方法，會得出不準確的結果或引起嚴重的假象。所以我們參照液體深層發酵的檢測，盡可能建立穩定性強，抗干擾，適應度廣的方法。在這個前提下，提出五個生理參數，對固體發酵進行調控。

1，        失重比
在衡量液體發酵過程中的宏觀變化時，生物量的變化是一個重要指標。這是因為發酵液可以看作是“菌懸液”，而視為一種不易沉淀的懸濁液。通過離心，可以把細胞和液體分開，而得到所謂“濕菌濃”或再烘干，得到“干菌濃”。并且由于菌體和溶液的物理性質差異，在全水溶培養基中，可以通過分光光度法測得細胞量的變化。或者，應用發酵液攪拌充分，粘度大，細胞不易沉降的特點來吸取部分發酵液進行平板涂布，通過數菌落的方法算出單位溶液內的活菌數。
但是，固體發酵工藝受本身物料性質和細胞代謝的限制，就不能套用類似的方法來簡單的衡量宏觀代謝。這是因為固體發酵的含水量極低，大概在50%左右。這種情況下，不僅微生物細胞不能自由移動，就是水溶性營養物質也是相對固定的。由于培養及配方組成中各組分物理性狀的差異，特別是透氣能力帶來的極短位移上代謝強度的急劇變化，即便是單細胞微生物培養工藝，也使得取樣粉碎進行平板涂布測量平均單位體積內活細胞量變得不可能。更不用說離心菌濃和分光光度法測得OD值的可能性了。
但是，按照發酵動力學原理，發酵過程的能耗速率，是和活細胞量呈正比關系的，也就是說，可以通過對能耗的描述，來控制宏觀代謝的強度。而能耗可以看做主要是以二氧化碳和氨氣損耗掉的重量。
在固體發酵中，如果把所有單個活細胞的能耗速度看做相同，則對干重的損失量的微分，是和生物量成正比的。在習慣了這種描述后，即便不做微分，也可以通過對干物質重量損耗的描述，實現對細胞宏觀代謝的把握。
這就可以提出“失重比”的概念，即，經過若干小時發酵后，干物質相對起始時間的損耗率。

2，        pH值
僅僅一個參數是不能描述生理代謝的，在引入新的參數時，首先注意到最方便測得的參數之一是pH值。
同樣由于含水量的問題，使得常規的工業用pH測定儀不能直接用在固體發酵工藝中，而用微觀pH儀實現工業測定又不現實，這就只能使用一種約定的方法，測定相對的pH變化。
暫時規定，每20克烘干固體發酵物料混合于200毫升中性水的過濾液的pH為指定pH值，進行個發酵批次間或同批次不同樣本間比較。
3，        還原糖或總糖
依據固體發酵工藝和培養基配方的不同，可以進行還原糖或總糖的檢測。樣本處理方法參考pH值的檢測，應用液體深層發酵還原糖，總糖檢測方法，得出單位干重所含還原糖或總糖含量。單位為質量百分比。

4，        氨基氮
同樣依據固體發酵工藝和培養基配方的不同，參考液體深層發酵氨基氮檢測方法，進行氨基氮含量的檢測。單位為毫克/千克。

5，        溶磷
同樣依據固體發酵工藝和培養基配方的不同，參考液體深層發酵溶磷檢測方法，進行固體發酵可溶性磷含量的檢測。單位為毫克/千克。

對于取樣方式，同樣由于物料的含水量過低，而帶來的單一樣本不能代表全部物料的性質，而對取樣方式提出了不同于一般液體發酵工藝監測取樣的要求。

首先，由于物料不能流動，則取樣必須多取。其次，取樣不能參照原料監測和成品檢測的方法選點，即不能分散選點和隨機選點，而應該在最具有代表性或最正常的部位選點。

目前的方法是，在最具有代表性的區域，隨機選取五個點，進行取樣，檢測后，把最接近的三個值求算術平均，而把其余兩個值舍掉。

葉赫娜蘭.孤城

5.固體發酵過程監測實例與應用效果

對生理數據的分析作用發揮最大的地方是發酵過程工程，也就是工藝路線的選擇和工藝參數的制定及其實現，其次是在成熟工藝的日常發酵過程中。下面的例子，通過對發酵過程中生理參數的測定和分析制定了工藝，可以看做是過程檢測的初步實際應用。

實驗地點：山東大學生命科學學院，微生物技術國家重點實驗室，國家糖工程技術研究中心，資源糖室。
所用設備：搖床，50升自控發酵罐，固體發酵床，烘干箱，定量取樣器（自制），常規檢測設備。
所選菌株：米曲霉AS3951，為資源糖室保藏。
工藝條件：固體發酵，物料浸泡但不消毒。控制溫度為發酵室空氣溫度30℃，料溫35℃。起始pH6.5。控制濕度接近飽和。
工藝配方：干物料85%豆粕，其余略，含水量略。
取樣周期：每三小時一次。
發酵數據：見表2。

周期        0        3        6        9        12        15        18        21        24
失重比        0%        0.5%        3.0%        7.0%        8.0%        14.0%        16.0%        17.0%        17.0%
pH        6.55        6.48        6.45        6.41        6.54        6.87        6.90        6.95        6.85
還原糖        3.2        3.4        3.8        3.0        1.8        1.4        1.4        1.4        1.4
氨基氮        320        320        320        280        400        480        520        360        360
   
表 2   豆粕發酵過程參數

如表2所示，在15小時后，物料的pH已經下降到最低點，并且反彈。而氨基氮則在15小時后達到最高，以后逐漸下降。同時，在15小時達到能耗速率最高，表現為相對失重比（失重比的斜率）最高。也就是具有較高代謝活性的生物量達到最高。以后，相對失重比降低并趨于平緩，說明進入穩定期和衰退期。

以上情況可以這樣理解，在六小時之前的能量損耗，可以理解為延遲期后期和對數期前期在細胞指數生長之前的積累。而后進入對數生長期中期。在這個階段，如同液體發酵一樣，主要是一個利用碳鏈而不是氮源的過程。并且由于還原糖的利用產生有機酸，似的pH下降。在15小時左右，達到生物量高峰，由于胞外酶的作用，而使得氨基氮達到最高。后來，由于在所謂穩定期實際上細胞活性的降低，而氨基氮，相對失重比都下降了。

對于還原糖的測定，也印證了以上數據。至于后期還原糖檢測值趨于穩定，原因也和液體發酵一樣，在一定濃度一下的還原糖不再為細胞所識別，而達到最低值。在這以后，除了能夠進一步利用胞外酶降解蛋白外，考慮到氨基氮以氨氣的形式揮發掉，繼續發酵就是對物料的單方面無意義的消耗了。

在以上實驗中，由于配方中較多的應用磷酸鹽為緩沖劑，所以磷的基礎較高，溶磷損耗在生物轉化中不具備可觀性，故省略監測。

考慮到應用的是固體不消毒發酵工藝，目標為盡可能多的菌體量和合理處理豆粕但不造成浪費，并且盡可能短的發酵周期以盡可能減少雜菌污染的機會，提高工藝穩定性，故，最后確定，當應用嚴格的工藝，使用米曲霉AS3951進行單菌株固體發酵豆粕時，發酵時間為15-20小時。其他參數如pH值，溫度，含水量等暫依文獻或以往經驗，不作調整。

葉赫娜蘭.孤城

6.結論
   
目前在發酵豆粕一般應用中，文獻可以查到的固體發酵工藝，無一具有過程控制，而實現過程控制是真正工業化的前提。要想實現控制，必須進行發酵生理數據的采集與分析。目前參照液體深層發酵工藝所選用的檢測方法是有效地。

由于參數選取過程中就考慮到工業應用，這些參數具有快速檢測的可能。

不僅僅是霉菌，在任何有可能進行工業化發酵的場合，如其他真菌（如擔子菌），酵母菌，細菌，甚至放線菌，或者，不僅僅是發酵豆粕，包括其他方面，這些參數和對過程的控制方式，都是可取的，值得繼續發展的。

參考文獻：

《微生物技術開發原理》，曲音波，化學工業出版社
《生物體系中的化學測量》，上官棣華，趙睿等譯，化學工業出版社
《微生物學》，郭秀君，山東大學出版社
《發酵豆粕研究進展》，李建，《糧食于飼料工業》，2009，NO.6

穆然

呵呵呵呵.....孤城的專業,很不錯的資料

牧場俠客

再多發點

葉赫娜蘭.孤城

好帖子總是要沉的。