豆粕發酵過程參數與檢測方法的建立

葉赫娜蘭.孤城

以前的一篇論文，直接上了，和大家分享。

歡迎討論，歡迎批評。

因為是強調“參數選取”，所以，試驗并沒有更多的羅列。

希望這個思路會對搞發酵的同行有所觸動。

葉赫娜蘭.孤城

摘要：考慮到經典液體發酵40%左右的動力費用為發酵豆粕的附加值所不能接受，又加上圍繞原料展開工藝和由于沒有明確，單一產物所允許的較大的工藝彈性，豆粕發酵可以采用固體發酵工藝。

固體發酵工藝是在成本壓力和以原料處理為目的允許下采取的次于液體發酵工藝的工藝路線，為此，帶來的是工藝可控性的降低。

鑒于這種局面，既然已經選用固體發酵工藝，則，出于對加強工藝穩定性的考慮，使用好氧發酵，在短時間內結束發酵工藝，以縮短時間的方法，減少工藝風險，把發酵風險控制在工藝及成本許可之內，就成了首選。

現在的豆粕發酵，不應該繼續農業發酵或食品發酵的工藝路線，現在的豆粕發酵沒有得到，也不可能有時間得到幾百年的經驗積累。而液體深層發酵，卻在近百年的發展中積累了大量的技術經驗，包括檢測方法，數據分析，控制反饋，甚至設備選型，物料平衡等等。第一步，先實現穩定的固體發酵工藝，參照液體深層發酵建立固體發酵過程參數，是必然的選擇。

事實證明選取的過程參數在描繪和控制發酵過程上是有效的。在建立了有效地檢測/監測機制后，發酵豆粕乃至整個固體發酵工藝，將擺脫不能控制的局面，而大幅度提高工藝穩定性。

葉赫娜蘭.孤城 于 2010-6-18 17:39 補充以下內容

關鍵詞：豆粕發酵；工藝穩定性；檢測-反饋；固體發酵生理參數

葉赫娜蘭.孤城

1.        豆粕發酵的意義

一方面由于因為魚粉等高端蛋白飼料價格的提升，深加工豆粕作為一種魚粉的替代品而被開發。另一方面，作為一種常見的大宗原料，深加工是原料提高綜合效益的有效方法。

對于豆粕的處理，主要集中在酶解，發酵等生物方法中。相對于酶解只是簡單的對蛋白進行切割，發酵是在酶解蛋白的同時，利用微生物的代謝產生大量的活性物質或成味物質。因此具有單純酶解所起不到的作用。

對此業內已經形成統一的認識，即發酵是目前最有力的豆粕處理方法。

2.        豆粕發酵工藝選擇與目前存在的問題

豆粕發酵，目前達成共識的是使用固體發酵工藝，在此基礎上，又有厭氧與好氧之別。往往是出于對代謝效率的追求或穩定性的強調而選用好氧工藝，而出于對較高的得率的追求或低成本的強調而選用厭氧工藝。

出于商業運作的緣故，海外廠家對自己的發酵工藝持保密態度，如：丹麥的哈姆雷特公司的HP300和HP400，美國ADM公司的Soycomil K,臺灣的惠勝實業公司生產的“比多?！钡?。

可以推測，只要是在飼料中應用的大宗原料，就不會是應用液體發酵工藝。但是，相對于液體深層發酵工藝，固體發酵工藝（尤其是國內的固體發酵工藝），卻普遍存在產品著穩定性差，過程難以控制或根本沒有過程控制的現狀。嚴重制約發酵豆粕工藝的開發與應用。

沒有穩定的產品就沒有所謂產品的比較，沒有穩定的可重復的生產過程，就談不上穩定的產品。所以，相對于出于對發酵效果的強調，而進行的菌株選用的爭論，發酵過程的穩定性，是目前的尖銳問題。

葉赫娜蘭.孤城

固體發酵工藝的選取

所有的生化反應，都是在水環境（或稱水溶液）中進行，水活度是保證代謝效率的最重要因素。出于效率的考慮，一般大工業發酵工藝，如抗生素，氨基酸，有機酸，優先選用液體深層發酵工藝。使得液體深層發酵工藝得到了大量的技術積累。由于發酵是一個結合微生物學與化工合成，機械制造的跨行業，跨學科的系統工程，原有的技術積累也加強了工程人員進行工藝路線選取時對液體深層發酵工藝的傾向。只有當液體深層發酵工藝不能得到產物或副產物太多且有毒的情況下，才會考慮使用固體工藝。

但相對于一般經典發酵“單一菌種，單一產物”的模式，豆粕發酵有它的特殊性，即：

1，沒有明確的，單一的產物。
2，附加值相對抗生素等經典發酵要低的多。
3，是以大宗原料處理，即圍繞原料為中心展開的工藝，而不是圍繞產物為中心展開的工藝。

這樣，考慮到經典液體發酵40%左右的動力費用為發酵豆粕的附加值所不能接受，又加上圍繞原料展開工藝和由于沒有明確，單一產物所允許的較大的工藝彈性，豆粕發酵可以采用固體發酵工藝。

固體發酵工藝是在成本壓力和以原料處理為目的允許下采取的次于液體發酵工藝的工藝路線，為此，帶來的是工藝可控性的降低。

鑒于這種局面，既然已經選用固體發酵工藝，則，出于對加強工藝穩定性的考慮，使用好氧發酵，在短時間內結束發酵工藝，以縮短時間的方法，減少工藝風險，把發酵風險控制在工藝及成本許可之內，就成了首選。

當然，也可以應用厭氧發酵，來得到較高的收率，就需要較長的時間。這樣有可能使工藝的發酵風險成本增高，是否合理，有待考察。

但是，不管是厭氧發酵還是好氧發酵，出于工藝穩定性考慮，對發酵過程實行全程可控，是固體發酵工藝必須要解決的問題。

葉赫娜蘭.孤城

固體發酵工藝沒有提供可供過程控制的過程參數

發酵工藝的第一品質是穩定性，穩定性是工業化的保證。而工藝穩定性的外在表現，是可重復性。作為大宗原料的處理，豆粕發酵對穩定性的要求是相當高的。作為發酵工藝，穩定性或可重復性的實現，是通過全程可控來實現的。也即，全程在均勻時間點取樣，檢測生理參數，回饋發酵控制，以實現發酵過程。沒有監測的發酵過程是不可想象的，液體深層發酵對此積累了大量的經驗，包括檢測方法及數據處理。

但是，固體發酵工藝并沒有相應的豐富的檢測/監測數據，更談不到數據處理技術的經驗性積累。

2.2.1歷史淵源與技術積累

產生這種狀況的原因在于固體發酵的淵源。

目前的固體發酵工藝，起源于兩個源流，一個是傳統農業中食用菌栽培與微生物純培養技術的結合，一個是食品發酵工業中白酒，啤酒，醬油的古典發酵技術。

也就是說，與經典發酵的液體深層培養技術不同，固體發酵，并不是以化工為前身，用化工合成工程思想與技術去結合微生物理論而得到工藝，也不是把液體深層發酵技術中的液體培養基“固體化”，而是起源于農業和食品業。這樣，一般的固體發酵沒有借鑒化工合成的單元操作，過程控制與檢測等等思想與技術。也沒有相應的技術積累。

農業微生物技術和食品發酵工程是積累了幾百，甚至上千年經驗的，以經驗模糊控制的工藝過程。是一個復雜體系。而目前的豆粕發酵卻只有十幾年經驗積累，作為大宗原料發酵，豆粕發酵工藝沒有明確檢測參數，沒有完整，嚴格的過程控制的現狀，是不能實現穩定化生產的。

豆粕發酵規模化，工業化的要求，是全過程可控，目前的固體發酵技術積累不能實現這個目標。

2.2.2固體發酵的物料性質（與液體深層發酵相比較）

造成這種現狀的另一個原因是固體發酵的物料性質。

與液體深層發酵不同，固體發酵工藝往往不使用攪拌（淺盤或發酵床，固體發酵塔），或僅僅使用較溫和的攪拌（絞龍式發酵槽）。與液體深層發酵工藝的劇烈攪拌與劇烈鼓泡不同，在液體環境下，認為任一個質點的情況代表了整個發酵罐任何一個質點的情況，在激烈的湍流下，液體深層發酵工藝的發酵液被認為是均勻的。而固體發酵工藝卻不能被認為是均勻的，這樣就使取樣趨于困難。

由于任意選點不具備代表性，而取樣方法并不是一般發酵過程工程師所關注的，也使檢測項目的選取及對此的數據處理以實現過程控制的思路沒有應用在固體發酵工藝中。

葉赫娜蘭.孤城

3.        參照液體深層發酵建立固體發酵過程參數

現在的豆粕發酵，不應該繼續農業發酵或食品發酵的工藝路線，現在的豆粕發酵沒有得到，也不可能有時間得到幾百年的經驗積累。而液體深層發酵，卻在近百年的發展中積累了大量的技術經驗，包括檢測方法，數據分析，控制反饋，甚至設備選型，物料平衡等等。第一步，先實現穩定的固體發酵工藝，參照液體深層發酵建立固體發酵過程參數，是必然的選擇。

3.1液體深層發酵參數簡介

液體深層發酵工藝認為，發酵液為一個均勻的，處于激烈湍流狀態的氣，液兩相或氣-液-膠三相的可壓縮的非牛頓流體。在這個體系內，任一點的代謝狀況，可以代表整個發酵罐內發酵液的代謝狀況，則，整個過程監控過程，可以分為取樣----檢測/監測----反饋三部分，至于選取參數的依據，則堅持以下原則：

1，易于取得或檢測。
2，與代謝實時相關。
3，抗干擾，檢測值散布小。

鑒于以上原則，液體深層發酵的監測數據，并不是按照便于理科研究，二是便于工程操作選取的。

3.1.1常見液體深層發酵過程參數

發酵過程參數，一般等同于生理參數，用以反饋和控制整個發酵過程。

一般常見的生理參數為：pH值，生物量（用菌濃，濕菌體含量，干菌體含量，涂布菌落，細胞量，OD值等來表示），糖含量，氨基氮含量，可溶性磷含量，效價（目標產物含量），溶氧，尾氣中氧，二氧化碳含量，發酵過程熱量的產生速率（一般通過降溫水流量標示），等等。其中，常用的為pH值，生物量，糖，氮，磷含量和目標產物含量。

其中，最為常用的是pH值，生物量，糖，氮，磷和效價。

包括pH，以上參數，基本可以看做是物質在水相里散布的濃度或其函數。依照這幾個簡單的參數的分析，可以確定液體深層發酵幾乎全部的工藝要求，并實現嚴格的具有可重復性的發酵過程控制。

3.1.2檢測參數（或曲線）的構成

不連貫的數據不能用來實現過程控制，不了解曲線的由來也不能進行有效的分析，必須明白參數的構成。

參數的構成，包含兩個問題。第一是在認為攪拌均勻的前提下，數據的連續性問題。即取樣受工藝反饋對發酵液濃度稀釋或濃縮或改變，是否能夠表現代謝過程的問題。第二是檢測曲線構成或曲線復合的問題，也即真實度的問題。

面對第一個問題，由于所有生理參數都是用濃度來表示的，以最常用的分批補料發酵，看某底物（或產物）總量變化的情況下，不計誤差時，在檢測上的表現。

C1=S1/V1

C2=S2/(V1+V2-V3-V4)

△C=C2-C1

其中，C1為上班次檢測值，C2為本班次檢測值,△C為本班次變化值。
S1為上班次總底物量，S2為本班次總底物量。
V1為上班次發酵液體積。
V2為上班次補料量。
V3為上班次取樣量。
V4為上班次呼吸損耗量。

事實上是，與V1相比，取樣量和呼吸損耗基本可以忽略，而總補料量雖然很大，但每班次的補料量不會超過總體積V1的1/20，這時的誤差，當S相對V1很小時（這正是液體深層發酵的特點），相對于檢測的系統誤差，還是比較小的。所以，在液體深層發酵中，工藝反饋對數據的影響是在可接受的范圍之內的。即，對于發酵過程，在檢測誤差可以接受時，把C1，C2看做連續的監測數據是可信的。也即△C可以看做是由于連續的代謝被細胞合成消耗或細胞裂解釋放的某底物變化。

第二個問題，即檢測值C=f(t)------（t為時間）的參數構成，或當C繪成曲線后，該曲線是由幾條曲線復合而成。

除了C函數所試圖表現得S的真實濃度，也即真實值外，C還由另外兩個函數構成。

首先，由于液體深層發酵的發酵液是氣-液-膠三相的非牛頓流體，且隨著時間的進行，粘度這個監測誤差函數的影響最大的參數也越來越大，所以粘度誤差會是一個在X軸兩側振幅越來越大的一個震蕩函數。

其次，是監測的隨機誤差。

這兩個誤差也是C曲線的重要構成部分。

由此可見，雖然我們得到了唯一的檢測值，但C=f(t)表現得不是S濃度的真實值。檢測值將會隨發酵時間的延長而受到更大的干擾。

C構成的曲線是連貫的（第一個問題），又是不能完全信賴的（第二個問題），在這種情況下的數據分析，液體深層發酵工藝的基于監測的過程控制積累了大量的數據處理技巧（如差商，擬合等）與經驗。

類似的情況，會出現在固體發酵等任何需要選取過程參數和分析過程參數的工藝過程中，液體深層發酵的監測與分析技巧，也必須在固體發酵過程控制中得到借鑒和應用。

3.2參照液體深層發酵初步建立固體發酵過程參數

固體發酵（包括豆粕發酵），其過程控制，不應該選用傳統發酵的以來經驗的模糊模式，而應該建立一套有效地，全面的，實時控制的檢測-反饋體系，以實現工藝過程的可重復性以及產品的穩定性。

經歷了長時間的大工業生產，類似的體系，在液體深層發酵工藝中已經廣泛應用，在建立固體發酵的檢測-反饋體系時，可以借鑒其思想，方法和技巧。

3.2.1擬建立的取樣方法與擬檢測過程參數

一旦突破固體發酵淵源方面的限制，而進行生理參數的選取和檢測，則在借鑒液體深層發酵工藝以建立檢測體系的過程中，最大的障礙就是物料的物理性質。

由于固體發酵物料不是均勻的，這就要求取樣不能任意選取，而應該在最能代表大部分或絕大部分物料的點，選取不止一個的點進行檢測，然后去掉離群值，平均其余的檢測點以盡可能得到散布較小的，有連貫性的數據。

按照發酵行業檢測的習慣，所有生理參數檢測都是在較稀的水溶液中進行。工業化檢測的經驗顯示，在水溶液中進行的定量檢測，比固體條件下的檢測要精確地多。依照這個慣例，固體發酵工藝過程參數也應該選用與液體深層發酵類似的過程生理參數。

另一方面，選用類似的參數的另一個好處，是借鑒液體深層發酵對數據處理的經驗。必經，所有發酵過程工程師是面對同樣的參數進行工作的。

固體物料有固體物料的特點，所取樣本，也為固體，這就需要溶解到定量的水溶質中，來進行檢測和比較。目前，本實驗室暫定為：

迅速烘干樣品至恒重，然后稱量10g至100g純水中，震蕩溶解，取上清液檢測。檢測項目與檢測方法參考液體深層發酵。

這樣，可以進行比較的是pH，糖，氮，磷。

還有一個重要的參數是生物量的檢測。在液體深層發酵工藝中，生物量用離心法得到菌體，然后烘干測干菌重或不烘干測濕菌重，有時，也用比色法或血球計數儀，平板涂布測菌數。

但是固體發酵沒有可以類比的可行的檢測方法。不僅僅離心不可取，由于很多時候在微觀環境物料的營養水平也有差異，造成生長不均勻，即便平板涂布也不能體現代謝情況，更不能使檢測值的散布被允許在可以保證數據連續性的范圍內，也就沒有進行曲線分析的意義。在固體發酵中，用直接測量生物量的方法不能進行過程分析和控制。

這樣就引入一個新的參數，用能量損耗的總量來衡量代謝過程，就可以通過計算函數的導數得到代謝強度，取代原來液體深層發酵中對生物量及其變化的描述。

這個量即單位重量的物料經過一定時間發酵后重量的變化。暫命名為“失重比”。

3.2.2按預想取樣方法，比較液體深層發酵，固體發酵過程生理參數的構成

比較液體深層發酵，固體發酵的過程生理參數同樣面臨數據連續性和真實度的問題，對于發酵過程控制來說，沒有解決這兩個問題的數據是沒有意義的數據。

由于檢測方法的雷同，關于真實度的問題固體發酵面臨著與液體深層發酵相同的曲線構成，即，檢測曲線是由真實值和一個震蕩函數與隨機函數復合而成的。在曲線中，震蕩函數和隨機函數對數據的影響，可以通過經驗和數據處理技術盡可能的去除。這里借鑒液體深層發酵的技巧。另一方面，看一下數據連續性。

在固體發酵過程中，檢測值的索取是取樣后烘干重溶后檢測的到的，所以，水分的變化可以不予考慮。那么：

C1=S1/G1

C2=S2/（G1-△G）

△        C=C2-C1

其中，C1為上班次檢測值，C2為本班次檢測值,△C為本班次變化值。
S1為上班次總底物量，S2為本班次總底物量。
G1為上班次發酵液重量。
△        G為上班次呼吸消耗量。
   
    雖然在整個固體發酵過程中，重量損失是不容忽略的。因為工藝和菌株的不同，重量損耗可從10%-30%不等，但由于取樣點密集，每班次的損耗不會很大，所以可以看做G1≈（G1-△G），即，固體發酵的檢測數據是連續的，能夠依此進行過程分析。

葉赫娜蘭.孤城

4.        失重比，pH，還原糖與氨基氮的檢測實例
   
為了驗證參數選取的合理性與可行性，進行了部分發酵豆粕固體發酵工藝過程控制的探索，以下是其中一個實例。

實驗地點：山東大學生命科學學院，微生物技術國家重點實驗室，國家糖工程技術研究中心，資源糖室。

所用設備：搖床，50升自控發酵罐，固體發酵床，烘干箱，定量取樣器（自制），常規檢測設備。

所選菌株：米曲霉AS3951，為資源糖室保藏。

工藝條件：固體發酵，物料浸泡但不消毒?？刂茰囟葹榘l酵室空氣溫度30℃，料溫35℃。起始pH6.5。控制濕度接近飽和。

工藝配方：干物料85%豆粕，其余略，含水量略。

取樣周期：每三小時一次。

發酵數據：見表1（由于應用大量磷酸鹽為緩沖劑，溶磷在較大的基數下為一平行于x軸直線，故表中沒有列出相應的檢測數據）。

周期        0        3        6        9        12        15        18        21        24
失重比        0%        0.5%        3.0%        7.0%        8.0%        14.0%        16.0%        17.0%        17.0%
pH        6.55        6.48        6.45        6.41        6.54        6.87        6.90        6.95        6.85
還原糖        3.2        3.4        3.8        3.0        1.8        1.4        1.4        1.4        1.4
氨基氮        320        320        320        280        400        480        520        360        360

   表1    豆粕發酵過程參數

如表1所示，在15小時后，物料的pH已經下降到最低點，并且反彈。而氨基氮則在15小時后達到最高，以后逐漸下降。同時，在15小時達到能耗速率最高，表現為相對失重比（失重比的斜率）最高。也就是具有較高代謝活性的生物量達到最高。以后，相對失重比降低并趨于平緩，說明進入穩定期和衰退期。

事實證明選取的過程參數在描繪和控制發酵過程上是有效的。在建立了有效地檢測/監測機制后，發酵豆粕乃至整個固體發酵工藝，將擺脫不能控制的局面，而大幅度提高工藝穩定性。

參考文獻：

《微生物技術開發原理》，曲音波，化學工業出版社
《生物體系中的化學測量》，上官棣華，趙睿等譯，化學工業出版社
《微生物學》，郭秀君，山東大學出版社
《發酵豆粕研究進展》，李建，《糧食于飼料工業》，2009，NO.6