產蛋白酶菌株枯草芽孢桿菌的分離

zhenzuyulu

枯草桿菌是屬于芽孢桿菌屬的一類細菌。枯草芽孢桿菌的分布十分廣泛，主要存在于土壤或腐爛的稻草之中。由于能夠形成芽孢，因此能夠抵抗高溫，低溫等不良環(huán)境，所以是實驗室及工業(yè)生產中主要污染菌之一，危害極大。但是許多枯草芽孢桿菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物質，是工業(yè)酶制劑生產的重要菌種。例如，我國使用的BF7658枯草芽孢桿菌生產а-淀粉酶，用于淀粉水解，紡織品退漿等。又如AS1398枯草桿菌是生產蛋白酶的重要菌株。
1. 枯草芽孢桿菌的芽孢耐熱的特點。
由于芽孢具有較強的抗高溫能力，分離純化時可采用熱處理的方法，即通過高溫加熱殺死其中不生芽孢的菌種，使耐熱的芽孢菌得到富集。
2. 枯草芽孢桿菌的產酶特征。
利用枯草芽孢桿菌產生水解酶的特性，可以選擇酪蛋白或淀粉為主要營養(yǎng)成分的分離培養(yǎng)基，因菌體分泌的酶可以將大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周圍形成透明圈。根據(jù)透明圈直徑(H)和菌落直徑(C)之比值(H/C)可以初步確定酶活力，其比值越大，酶活力越高，進而可篩選出高產酶活的菌株。
3. 枯草芽胞桿菌的形態(tài)特征
枯草芽孢桿菌的細胞大小0.7×2～3 μm，營養(yǎng)細胞為桿狀，桿端鈍圓、單生或者短鏈，著色均勻，無莢膜，周邊運動，革蘭氏染色陽性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈橢圓或長筒形，常為兩端染色。菌落變化很大，枯草芽孢桿菌在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基斜面上，菌落呈細皺狀，干燥或顆粒狀。在土豆培養(yǎng)基上菌落呈細皺狀，干燥，有時呈現(xiàn)天鵝絨狀的菌苔，在液體培養(yǎng)基表面形成銀白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、擴展，不透明，不閃光，表面干燥，污白色或微帶黃色。
4. 枯草芽胞桿菌的生理生化特性
    枯草芽孢桿菌能夠液化明膠，凍化牛乳，還原硝酸鹽，不產生吲哚，H2S，V-P反應陽性，水解淀粉。1. 樣品：  從地表下10~15cm的土壤或者枯枝爛葉、腐爛稻草中用無菌小鏟、紙袋取土樣，
并記錄取樣的地理位置、pH、植被情況等。（學生自取）
2. 培養(yǎng)基
① 肉湯培養(yǎng)基（附錄Ⅱ-1.1）：100 mL/組，其中20 mL液體培養(yǎng)基/250 mL△中（內裝玻璃珠10顆）；50 mL固體斜面培養(yǎng)基分裝在試管中：5mL/支，10支。
組成： 牛肉膏0.5%   蛋白胨1%  NaCl 0.5%  pH 7.2～7.4  121℃，滅菌20min
② 酪素培養(yǎng)基（附錄Ⅱ-1.10）：200 mL/500 mL△×1（10-12個平板，每組6個平板）
組分        配方要求(%)        母液濃度(%)        各成分的取量（mL）/200ml
KH2PO4        0.036        3.6        2
MgSO4•7H2O        0.05        5        2
ZnCl2        0.0014        0.14        2
Na2HPO4•7H2O        0.107        10.7        2
NaCl        0.016        1.6        2
CaCl2        0.0002        0.02        2
FeSO4        0.0002        0.02        2
*酪素        0.4        4        20
Trypticase        0.005        0.5        2
瓊脂        2.0               
* 酪素的母液濃度為4%，是將4g干酪素溶解于0.1N的30-35ml的NaOH水溶液中，水浴溶解20min，待溶解完全后加入60-70℃熱水稀釋到所需濃度（即定容到100 mL），即得到母液濃度圍4%的酪素溶液。
各組分的母液由老師配制好，學生按照200ml的體積直接取樣加入即可。
pH 6.5～7.0，121℃，滅菌20min，倒好平板后進行無菌檢查。
③ 生理鹽水：0.85% NaCl水溶液，9 mL/支×10支
④ 其他：平皿10套、溫度計、水浴鍋、移液管、顯微鏡、涂布器2個，三角瓶（250mL， 500 mL規(guī)格）、革蘭氏染色液等。   
四、實驗內容
1.采樣
學生從地表下10～15cm的土壤中用無菌小鏟，紙袋取土樣，并記錄取樣的地理位置、pH、植被情況等等。
2. 增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)）
一般來講，樣品所占欲分離微生物的數(shù)量較少，利用微生物所需營養(yǎng)的區(qū)別，在增殖培養(yǎng)基中使某些微生物的生長受到抑制，而對某些微生物可促進它們的生長，從而達到分離所需微生物的目地，這種培養(yǎng)稱為增殖培養(yǎng)。
取土樣平攤于一干凈的紙上，從四個角和中央各取一點土，混勻，稱取1g，置于裝有20ml肉湯培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，六層紗布封口，于80℃水浴加熱處理10min，以殺死樣品中的微生物營養(yǎng)體細胞。然后30℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)24h。取樣鏡檢形成芽孢的情況。
3. 涂布分離
將增殖培養(yǎng)液置于80℃水浴中加熱10min，再次殺死不形成芽孢的營養(yǎng)體細胞，以濃縮芽孢桿菌（第二次加熱處理前，取1ml培養(yǎng)液經適當稀釋后作革蘭氏染色，觀察是否有枯草芽孢桿菌存在，本實驗中略去該步驟）。
然后取1 mL處理液以10倍稀釋法分別稀釋到10-4，10-5，10-6等。分別取0.1mL菌液于無菌的酪素培養(yǎng)基平板上（初篩平板，每個稀釋度平均兩皿），用滅過菌的涂布棒將菌液均勻涂布在酪素平板上，倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h。觀察酪素平板上菌落周圍的透明圈，挑(H/C)比值大的菌接入斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h，備用。
4. 純化
   用平板劃線分離法在酪素平板或牛肉膏蛋白胨平板上分離純化挑選出的菌株。
5. 純種鑒定
   菌種經革蘭氏染色，油鏡觀察，從細胞形態(tài)及菌落特征進行鑒別。
  ① 細胞形態(tài)，菌落特征，芽孢形成情況。
  ② 產蛋白酶能力的測定：直接觀察在酪素平板上菌落周圍所形成的透明圈。
6.菌種保藏   該實驗分離得到的枯草芽孢桿菌作為后續(xù)實驗的菌種使用。
葡萄糖發(fā)酵產酸不產氣，需氧，適溫25～31℃生長。

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