抗菌肽知識系列大講堂（十）

輕松由我 · 發(fā)表于 2010-5-4 15:58:23

抗菌肽的基因工程表達（二）

酵母表達系統(tǒng)：

1. 酵母表達系統(tǒng)的特點
雖然大腸桿菌是目前最為成熟的基因表達系統(tǒng)，但作為原核生物，它不具有真核生物的基因表達調(diào)控機制，也不具有對外源蛋白的加工修飾能力。近年來，人們已經(jīng)將注意力轉(zhuǎn)移至跟大腸桿菌同樣具有繁殖快、易于培養(yǎng)、遺傳操作簡單、可工業(yè)化生產(chǎn)等特點的酵母表達系統(tǒng)，并且除了上述優(yōu)點以外還具有使蛋白折疊、磷酸化、糖基化、酰胺化等修飾能力，避免了蛋白以包涵體形式表達、活性降低等問題。

酵母表達系統(tǒng)中最早使用的是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，曾經(jīng)用其成功表達過干擾素、胰島素等外源基因，但在工業(yè)應(yīng)用時其缺點也逐漸顯現(xiàn)出來，如培養(yǎng)基成本高、容易發(fā)生過度糖基化、質(zhì)粒丟失、拷貝數(shù)下降等。為了克服釀酒酵母的局限，美國Daly等最先發(fā)展了以甲基營養(yǎng)型酵母(Methylotrophic yeast)為代表的第2代酵母表達系統(tǒng)。其中巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是發(fā)展最為迅速的，最初這種酵母菌是用于生產(chǎn)家畜飼料單細(xì)胞蛋白，它可以在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，其細(xì)胞中含有醇氧化酶(Alcoholoxydase，AOX)、二羥丙酮合成酶、過氧化氫酶等甲醇代謝途徑必須的酶。畢赤酵母表達系統(tǒng)具有多種有利于外源基因表達的優(yōu)勢，與其他系統(tǒng)相比，更加便捷、高效，近幾年每年報道的在畢赤酵母中表達的外源基因就有幾十種。美國FDA評價該系統(tǒng)是安全的，并且已有來自于該表達系統(tǒng)的蛋白類制劑獲得批準(zhǔn)。與其他表達系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達系統(tǒng)具有以下特點：

(1)巴斯德酵母具有很強的醇氧化酶基因(AOX)啟動子，可以嚴(yán)格調(diào)控異源蛋白的表達。

(2)巴斯德畢赤酵母有完備的發(fā)酵方法，可高密度連續(xù)培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中細(xì)胞干重可達100g/l以上，便于工業(yè)化生產(chǎn)。

(3)巴斯德畢赤酵母的表達產(chǎn)物表達量較高，并且既可以在胞內(nèi)積聚又可以分泌到細(xì)胞外，而其自身的分泌蛋白非常少，有利于純化。

(4)異源蛋白借助質(zhì)粒以單拷貝或多拷貝的形式整合到巴斯德畢赤酵母基因組中，有助于穩(wěn)定遺傳。

(5)巴斯德畢赤酵母翻譯后加工過程中的糖基化程度更合理。

當(dāng)然除了上述優(yōu)點，目前甲醇酵母表達系統(tǒng)也還存在著一些問題，如某些蛋白的表達量相對較低甚至不能表達；分泌表達產(chǎn)物不均一，存在聚合體、信號肽加工不完全、表達產(chǎn)物降解等。所以在實驗中還需不斷地摸索。

2. 基因的構(gòu)建及表達
目的基因的獲得可以從動物體中提取RNA，將其反轉(zhuǎn)錄擴增后得到cDNA，利用此方法已經(jīng)得到豬抗菌肽PR-39基因；或根據(jù)抗菌肽氨基酸殘基種類和其殺菌活性的相關(guān)性，替換某幾個氨基酸或?qū)?/font>2種抗菌肽基因結(jié)合構(gòu)造雜合肽。如將cecropin Bl5和17等位點的氨基酸替換后，其抗菌活性明顯提高；cecropin A N端1～7位和Milittin N端5～12位氨基酸雜合后，其產(chǎn)物具有熱穩(wěn)定性和高抑菌活性。目前在巴斯德畢赤酵母已表達的抗菌肽包括：人源抗菌肽LL-37，通過克隆cDNA，得到111 bp的重組基因，已在X一33中表達，所用質(zhì)粒為pGAPZB；來源于中國家蠶的ABP—CM4，在GSll5中以pPICZaA為載體，得到了3．8 ku的表達產(chǎn)物；Jin等同樣以pPICZaA為載體，在SMDll68中表達了cecropinA和magain-in2的雜合肽。