甜菜堿對脫氮假單胞桿菌發酵產ＶＢ１２的影響

wlei908

甜菜堿對脫氮假單胞桿菌發酵產ＶＢ１２的影響
                          來源：中國論文下載中心    [ 08-11-27 13:36:00 ]    編輯：studa0714


                                                  王振國　曹云峰　陳學軍　李永亮　李昆太　張嗣良
    [摘要] 通過研究不同甲基供體（甜菜堿和氯化膽堿）對脫氮假單胞桿菌發酵產VB12的影響，結果表明甜菜堿能顯著促進VB12的生物合成；在此基礎上考察了發酵培養基中甜菜堿濃度對VB12合成的影響，結果表明15 g/L的甜菜堿下VB12的合成量最高；進一步研究了甜菜堿對脫氮假單胞桿菌發酵過程的影響，結果表明發酵液中一定濃度的甜菜堿可以顯著提高δ-氨基乙酰丙酸的合成量，從而促進VB12的合成。
　　[關鍵詞] 甜菜堿；菌體生長；VB12合成；δ-氨基乙酰丙酸；脫氮假單胞桿菌
　　
　　[Abstract] The effect of different methyl-group donors (betaine and choline chloride) on vitamin B12 production in shake flasks with Pseudomonas denitrificans was studied, and the results demonstrated that the addition of betaine to the fermentation medium could greatly stimulate biosynthesis of vitamin B12. Betaine concentration in fermentation medium was further investigated in shake flask, as a result, 15 g/L of betaine was the most beneficial for vitamin B12 synthesis. Moreover, the effect of betaine on the fermentation of P. denitrificans was studied, it was found that the δ-aminolevulinic acid (ALA) biosynthesis could be significantly improved when betaine was kept at certain concentration in the broth, thus the biosynthesis of vitamin B12 was greatly increased.
　　[Key words] Betaine;Cell growth;Vitamin B12 biosynthesis;δ-aminolevulinic acid,;Pseudomonas denitrificans
　　
　　維生素B12（VB12）通常用來表示鈷胺素類化合物，它是一種重要的生物活性物質，可以用來治療惡性貧血癥，同時也是許多微生物和動物的生長因子[1]。自然界中，VB12的生物合成存在兩種不同的途徑，即好氧途徑和厭氧途徑，但是VB12的生物合成嚴格局限于一些微生物中[2]，目前用于商業化生產VB12的微生物主要有謝氏丙酸桿菌（Propionibacterium shermanii）、菲氏丙酸桿菌（P. freudenreichii）和脫氮假單胞桿菌（Pseudomonas denitrificans）等。P. denitrificans好氧合成VB12的途徑已經詳細闡明[3]。正是由于對VB12合成途徑的了解，所以可以通過誘變和分子生物學等手段來改造菌株，已經使得P. denitrificans菌株的VB12生產能力大大提高[2]。由于VB12產率高, 目前在工業生產中幾乎都是使用P. denitrificans來作為好氧生產VB12的工業菌株。P. denitrificans好氧合成VB12的過程一共需要8步甲基化[4]。氯化膽堿（氯化-β-羥乙基-N,N,N-三甲基銨）和甜菜堿（三甲基甘氨酸）的每個分子含有三個甲基，它們通常作為生物合成VB12的甲基供體。White等 [5]第一次報道在P. denitrificans中，甜菜堿-高半胱氨酸轉甲基酶對VB12的大量合成具有非常重要的作用。甜菜堿-高半胱氨酸轉甲基酶催化甜菜堿向高半胱氨酸轉移一個甲基，分別形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸[6]，因此甜菜堿在參與VB12生物合成過程中的甲基化具有非常重要的作用。Demain等[7-9]的研究表明，甜菜堿對P. denitrificans中VB12的合成和卟啉的過量生成起著重要的作用。另外，甜菜堿是一種良好的滲透壓調節劑[10]，有文獻報道甜菜堿和膽堿能促進細胞表面對代謝產物的分泌，從而對細菌產VB12具有刺激效果[11]。
　　甜菜堿在VB12發酵過程中具有非常重要的作用，但是目前很少有文獻對甜菜堿所引起的P. denitrificans代謝變化情況進行分析。本文主要考察了甜菜堿對P. denitrificans菌體生長和VB12合成的影響，并通過研究發酵過程pH和δ-氨基乙酰丙酸（ALA）合成量的變化，闡明了甜菜堿所引起的P. denitrificans代謝特征，為工業化發酵生產VB12中的甜菜堿控制工藝提供了重要依據。
　　1 材料與方法
　　1.1 菌種和培養基
　　菌種：脫氮假單孢桿菌（Pseudomonas denitrificans），石藥集團河北華榮制藥有限公司。種子培養基（g/L）：蔗糖 40，酵母膏 10， NH4Cl 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.1，pH 7.2~7.4。發酵培養基(g/L)：蔗糖 80，酵母膏 30，(NH4)2HPO4 3.0，MgSO4·7H2O 2.0，CoCl2·6H2O 0.1，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI） 0.05，ZnSO4·7H2O 0.1，CaCO3 1.0，pH7.0～7.2。
　　1.2 儀器與試劑
儀器：8453型紫外-可見分光光度計（Agilent公司）；HP 1100型色譜儀(Agilent公司)。
　　試劑：氰鈷胺對照品(含量＞99％，河北華榮制藥有限公司)，糖蜜（內蒙古蘭田糖業有限公司），甜菜堿(河北華榮制藥有限公司)，DMBI(河北科碩化工有限公司)，CoCl2·6H2O(山東臨縣匯豐鈷廠)，ALA (Sigma公司)，其他試劑均為國產分析純。
　　1.3 發酵培養方法
　　種子培養：用無菌水刮洗下斜面菌體，制成菌懸液。取1 ml菌懸液接入裝有60 ml種子培養基的300 ml三角瓶中，30 ℃，260 r/min旋轉式搖床振蕩培養至菌體吸光值(OD700)為10左右。搖瓶培養：300 ml三角瓶中培養基裝量為36 ml，接種量10％，32 ℃，于旋轉式搖床（260 r/min）培養至96 h。
　　1.4測定方法
　　菌體濃度(DCW)：采用測量菌體干重法(dry cell weight)。吸10 ml發酵液，經離心和洗滌后，菌體烘干至恒重，稱菌體干重。VB12測定：采用HPLC法。將被測樣品中不同形式的VB12轉化為氰鈷胺，流動相：V（250 mmol/L磷酸水溶液）∶V（乙腈）= 30∶70；色譜柱：大連依利特Hypersil NH2柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；檢測波長：361 nm；進樣量：20 μl；流速：1.7 ml/min。甜菜堿測定：比色法[12]，利用甜菜堿與雷氏鹽發生反應。δ-氨基乙酰丙酸(ALA)含量的測定：按照文獻[13]的方法進行測定。
　　2 結果與討論
　　2.1 兩種不同甲基供體對菌體生長和VB12合成的影響
　　甜菜堿和氯化膽堿每個分子都含有三個甲基，常常作為發酵產VB12過程的甲基供體。為了比較二者對P. denitrificans發酵產VB12的影響，在發酵培養基中分別加入10 g/L的甜菜堿、氯化膽堿，結果如圖1所示：



　　
　　圖1不同甲基供體對P. denitrificans發酵過程的影響
　　Fig. 1The effects of different methyl-group donors on cell growth（solid）(a), broth pH (dash) (a) and VB12 synthesis (b) of P. denitrificans in shake flask
　　
　　由圖1a可見，發酵培養基使用甜菜堿的菌體生長量明顯要高于使用氯化膽堿，其最大DCW分別為23.04 g/L和18.79 g/L。使用甜菜堿作為甲基供體，發酵過程中的pH較為穩定，一直維持在7.0左右。而使用氯化膽堿作為甲基供體，發酵液的pH急劇下降，第48小時后pH降低至5.0左右，pH的下降很可能是由于氯離子積累而造成的。
　　由圖1b可見，使用氯化膽堿的VB12效價明顯低于使用甜菜堿的VB12效價，二者放瓶時（96 h）的VB12效價分別為20.75 μg/ml和48.45 μg/ml。
　　2.2 甜菜堿濃度對VB12合成的影響
　　在發酵培養基中加入甜菜堿，濃度分別為0、5、10、15、20、30 g/L。發酵96 h后放瓶，結果見圖2。
　　圖2 不同濃度的甜菜堿對VB12合成的影響
　　Fig 2. Effect of betaine on the cell growth and vitamin B12 biosynthesis of P. denitrificans
　　
　　從圖2可以看出，在P. denitrificans發酵過程中，添加一定量的甜菜堿是十分必要的，它對VB12的合成具有明顯的促進作用。發酵培養基不加甜菜堿，雖然得到最大的菌體生物量，但是沒有VB12的合成。添加15 g/L甜菜堿的效果最好，VB12的效價達到52.18 μg/ml。
　　2.3 甜菜堿對P. denitrificans發酵過程的影響
　　為了研究甜菜堿對P. denitrificans發酵過程的影響，選擇15 g/L和30 g/L的甜菜堿在搖瓶中作進一步實驗，以不加甜菜堿作為對照。
2.3.1甜菜堿對pH和菌體生長的影響圖3為這三種不同濃度甜菜堿下，發酵過程的pH和菌體生長變化趨勢。
　　圖3不同濃度甜菜堿下發酵過程的pH和菌體生長變化趨勢
　　Fig. 2 Time course of pH (a) and cell growth (b) under various concentrations of betaine in shake flask culture by P. denitrificans.
　　Symbols: -■- 0 g/L of betaine; -●-15 g/L of betaine; -▲- 30 g/L of betaine
　　
　　由圖3a可見，培養基中不加甜菜堿，pH在第24小時后明顯下降，而加入15 g/L和30 g/L的甜菜堿，pH較為穩定。圖3b顯示的生物量變化表明，培養基中不加甜菜堿，菌體生長最快。此外，15 g/L甜菜堿下的菌體量明顯高于30 g/L甜菜堿下的菌體量。
　　2.3.2 甜菜堿對ALA和VB12合成的影響圖4為這三種不同濃度甜菜堿對發酵過程ALA和VB12合成的影響結果。
　　由圖4a可見，培養基中不加甜菜堿，發酵液中的ALA含量明顯低于15 g/L和30 g/L甜菜堿下的ALA含量。在72 h前，15 g/L甜菜堿下的ALA含量還略高于30 g/L甜菜堿下的ALA含量。由圖4 b可見，培養基中不加甜菜堿，整個發酵過程的VB12合成量為0。由于15 g/L甜菜堿下的菌體生長較快，其VB12效價明顯高于30 g/L甜菜堿下的VB12效價。
　　2.3.3 發酵過程甜菜堿的變化趨勢圖5為P. denitrificans發酵過程中甜菜堿含量的動態變化。
　　
　　圖5 發酵液中甜菜堿濃度的動態變化過程
　　Fig. 5 The dynamic change of betaine concentrations by the fermentation of P. denitrificans in shake flasks.
　　Symbols: -■- 0 g/L of betaine; -●-15 g/L of betaine; -▲- 30 g/L of betaine
　　
　　從圖5的甜菜堿的動態變化情況可以看出，在第48小時到第72小時期間，甜菜堿利用量最大。培養基加入15 g/L甜菜堿時，在放瓶時（第96小時）發酵中甜菜堿濃度降低到0.19 g/100 ml，這說明15 g/L的甜菜堿剛好滿足發酵過程對甜菜堿的需求，不會因為甜菜堿的不足而影響VB12的合成。但是隨著培養基中甜菜堿濃度增大，反而會因為甜菜堿過量而影響VB12的合成，而且這對發酵成本的控制也是很不利的。
　　3討論
　　3.1 關于P. denitrificans好氧合成VB12過程中甲基供體的選擇
　　從兩種甲基供體對發酵過程的影響可以說明，使用氯化膽堿作為甲基供體，導致發酵液的pH迅速下降，抑制了菌體生長和VB12合成過程中酶的活性，從而導致VB12合成速率下降。因此，選用甜菜堿作為P. denitrificans發酵產VB12的甲基供體是VB12發酵過程中很好的甲基供體。P. denitrificans發酵產VB12的過程中，在發酵培養基中添加一定量的甲基供體能顯著促進VB12的生物合成。而使用甜菜堿作為P. denitrificans發酵過程中的甲基供體，對發酵過程的pH控制和VB12的合成效率，都要明顯優于使用氯化膽堿。
3.2 關于甜菜堿作為甲基供體對P. denitrificans好氧合成VB12發酵過程的影響和在發酵過程中的使用
　　從甜菜堿對發酵過程的影響可以看出隨著甜菜堿濃度的增加，菌體量逐漸下降，這說明甜菜堿對菌體的生長有一定的抑制作用。培養基中不加甜菜堿，可能由于菌體生長代謝旺盛，糖耗加快（數據未列出），從而造成pH下降迅速。而甜菜堿對菌體的生長具有一定抑制作用，所以pH不會因菌體生長過快而明顯下降。
　　在P. denitrificans好氧合成VB12的途徑中， ALA是生成咕啉環的關鍵前體物，ALA 合成酶對ALA的合成起著非常重要的調節作用，它也是整個VB12合成途徑的關鍵酶之一[4]。Fa等[14]的研究表明，甜菜堿能顯著提高ALA合成酶的活性。由圖5的ALA和VB12變化可以推斷，由于甜菜堿能促進ALA合成酶活性的提高，從而促進了ALA和VB12的合成。但是發酵液中甜菜堿濃度過高，會對菌體的生長產生一定抑制作用，反而會減少ALA合成量，從而降低VB12的合成。
　　本實驗的結果還顯示，發酵培養基中甜菜堿濃度的高低不僅影響到ALA和VB12的合成，而且對P. denitrificans的菌體生長也會產生較大的影響。當發酵培養基中添加的甜菜堿濃度過高，會對菌體的生長產生較大的抑制作用，反而更加不利于VB12的合成。
　　鑒于P. denitrificans合成VB12對甜菜堿的需求以及甜菜堿對菌體生長的抑制作用，因此，在P. denitrificans產VB12的發酵過程中，可以采用甜菜堿補加工藝。通過甜菜堿的補加，在滿足VB12合成所必需的甜菜堿用量的基礎上，又不會因發酵液中甜菜堿濃度過高而影響菌體的生長。
　　[參考文獻]
　　[1]Hunik JH.Process for the production of vitamin B12[J].US Patent，2002.
　　[2]Martens J H, Barg H, Warren MJ, et al. Microbial production of vitamin B12 [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 58: 275-285.
　　[3]Warren MJ, Evelyne R, Schubert HL, et al. The biosynthesis of adenosylcobalamin (vitamin B12 ) [J]. Nat Prod Rep, 2002, 19: 390-412.
　　[4]Battersby AR, Leeper FJ. Biosynthesis of vitamin B12[J]. Topics in Current Chemistry, 1998, 195:143-193.
　　[5]White RF, Kaplan L, Birnbaum J. Betaine-homocysteine transmethylase in Pseudomonas denitrificans, a vitamin B12 overproducer[J]. J. Bacteriol, 1973, 113: 218-223.
　　[6]Mulligan JD, Laurie TJ, Garrow TA. An assay for betaine-homocysteine methyltransferase activity based on the microbiological detection of methionine[J]. Methods of Nutritional Biochemistry, 1998, 9: 351-354.
　　[7]Demain AL, Daniels HJ, Schnabel L, et al. Specificity of the stimulatory effect of betaine on the vitamin B12 fermentation[J]. Nature(london), 1968, 220: 1234-1235.
　　[8]Demain AL, White RF. Porphyrin overproduction by Pseudomonas denitrificans:essentiality of betiane and stimulation by ethionine [J]. J. Bacteriol, 1971, 107: 456-460.
　　[9]White RF, Demain AL. Catabolism of betaine and its relationship to cobalamine overproduction [J]. Biochim.Biophys, 1971, 237: 112-119.
　　[10]Felitsky DJ, Cannon JG, Capp MW, et al. The exclusion of glycine betaine from anionic biopolymer surface: why glycine betaine is an effective osmoprotectant but also a compatible solute[J]. Biochemistry, 2004,43: 14732-14743.
　　[11]Vandamme E J. Production of vitamins, coenzymes and related biochemicals by biotechnological process[J]. J Chem Technol Biotechnol, 1992, 53(4): 313-327.
　　[12]崔艷紅,黃現青. 甜菜堿含量測定與工業制備方法研究 [J]. 畜牧業, 2002,6:38-40.
　　[13]Burnham BF. δ-aminolevulinic acid sythase [J]. Methods in Enzymology, 1970, 17A: 195-200.
　　[14]Fa YH, Kusel JP, Demain AL. Dependence of betaine stimulation of vitamin B12 overproduction on protein synthesis [J]. Appl Environ Microbial, 1984, 47: 1067-1069.
轉貼于 中國論文下載中心 http://www.studa.net

fujianfuhq

學習了，謝謝

wlei908

歡迎大家交流甜菜堿在發酵行業中的應用經驗，技術資料，文獻報告等

業務小兵

樓主辛苦了