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發(fā)表于 2009-8-3 17:10:40
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一、
鹽霉素效價檢測現(xiàn)有方法簡介：
鹽霉素效價檢測使用的是微生物效價測定法中的管碟法，是利用微生物在特定培養(yǎng)基上的擴(kuò)散作用，用已知效價的標(biāo)準(zhǔn)溶液與未知效價的樣品溶液在含有短小芽孢桿菌的特定培養(yǎng)基上對照培養(yǎng)，根據(jù)產(chǎn)生抑菌圈的大小來計算樣品的含量。
二、
課題選擇
由于傳統(tǒng)的微生物測定法耗時長、誤差大，重現(xiàn)性差、成本高等諸多弊端，已不能滿足現(xiàn)代化生產(chǎn)的需要，隨著現(xiàn)代化生產(chǎn)的需要，隨著中國加入世貿(mào)組織和企業(yè)進(jìn)行FDA認(rèn)證，企業(yè)面對的市場不僅僅是國內(nèi)，而且還有國外市場，目前歐洲許多國家已不再使用微生物測定法測定藥品的含量，而是改用先進(jìn)的、更可信的HPLC法，因此為了提高檢測的準(zhǔn)確度，進(jìn)一步完善鹽霉素產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，選擇“高效液相檢測鹽霉素效價”。
三、
現(xiàn)狀調(diào)查
1)
檢測方法的調(diào)查 抑菌圈圓正及大小的影響
標(biāo)準(zhǔn)品與供試品不同質(zhì) 藥液的飛濺 培養(yǎng)基內(nèi)有小凝塊
培養(yǎng)基溫度不均勻
器具被污染
含有影響抗菌活性 試劑中賦型劑的影響
培養(yǎng)基雜質(zhì)
鋼管底部不平滑
物標(biāo)準(zhǔn)品與供試品不同
緩沖液ph和鹽濃度的影響
培養(yǎng)基溫度、擴(kuò)散
所用緩沖液不同
溶解所用溶劑不相同
批
系數(shù)、溶液濃度
方法誤差
細(xì)菌生長時間不同 菌種分離純化不及時
檢定菌放置時間過長
檢定菌 恒溫室溫度不穩(wěn)定
2)
檢測成本調(diào)查：生測法所使用的試劑多達(dá)10種以上，370恒溫室耗電量大，所用玻璃器皿成本高，致使單批測量成本60元左右，工段月成本高達(dá)12000元。
3)
人員調(diào)查：崗位化驗(yàn)員雖有多年工作經(jīng)驗(yàn)，但由于檢測方法完全由手工操作，過程繁瑣，工作量大，影響因素較多，易出現(xiàn)操作誤差，且人員的工作效率較低。
4)
儀器調(diào)查：抑菌圈測定儀重復(fù)掃描，重現(xiàn)性差，誤差在1-2％,致使同批樣品精確度差不能確保有良好的準(zhǔn)確度。
5)
試劑調(diào)查：所用試劑種類繁多，雜質(zhì)含量高，影響擴(kuò)散系數(shù)，從而造成測定結(jié)果不穩(wěn)定。
6)
環(huán)境因素調(diào)查：因?yàn)楸粡U棄的培養(yǎng)基內(nèi)帶有活的菌體，排放后對環(huán)境產(chǎn)生污染。
四、
活動目標(biāo)
1)
使檢測誤差控制在5％以下，提高檢測的準(zhǔn)確度。
2)
減少勞動量，節(jié)省人員，降低單批測定的成本。
3)
避免帶活菌體污物的排放，減少環(huán)境污染。
原因分析：降低檢測偏差的可控因素進(jìn)行分析。
降低偏差
| | 改變現(xiàn)有的檢測方法
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| 降低成本
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| | 盡量減少手工操作
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| | 選用更為精密的儀器
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| | 加強(qiáng)崗位員工的培訓(xùn)
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| 菌絲
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| 雜菌的影響
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| Ph及鹽濃度不合規(guī)定
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| 恒溫室溫度不穩(wěn)定
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| 組分配不同
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| 物質(zhì)不同
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| 賦型劑的影響
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| 鑒定菌的質(zhì)量
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| 加熱溫度過高
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| 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品不同質(zhì)
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| 被污染
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| 雜質(zhì)引起菌種擴(kuò)散
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| 擴(kuò)散系數(shù)
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| 操作人員技能
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| 試劑純度
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| 理論知識薄弱
| | 操作不規(guī)范
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| 檢測偏差大
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| 人員的主觀意識
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改用新方法，以提高檢測的準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性，使誤差控制在5％以下，并降低檢測成本。
對上述找出的可控因素進(jìn)行分析確認(rèn)：
| | | | | | | 檢測偏差超出5％
| 是
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| | | 重復(fù)測定誤差在1-2％
| 是
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| | | 手工操作煩瑣，失誤較多
| 是
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| | | 雜質(zhì)有可能對測定結(jié)果產(chǎn)生影響
| 否
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| | 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品不同質(zhì) | 二者直線不平行，斜率不等
| 否
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| | | 試驗(yàn)操作誤差
| 是
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| | | 影響抑菌圈的清晰度形成
| 否
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| | | 測定結(jié)果的穩(wěn)定性
| 是
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| | | 影響抑菌圈的圈正和大小以及培養(yǎng)溫度不穩(wěn)定從而影響測定結(jié)果
| 是
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（一）我們對以上分析找出關(guān)鍵因素制定對策：
| | | | | | | 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品不同
| 引起檢測誤差過大超過5%
| 尋找新的方法改變要因?qū)y量結(jié)果的影響
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| | 擴(kuò)散系數(shù)
| | 操作條件
| | 操作人員技術(shù)不穩(wěn)定
| | 儀器的穩(wěn)定性
| 穩(wěn)定性差
| 選用更為先進(jìn)的儀器
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| | 人員的主觀意識和技能
| 理論知識及操作技能較差、習(xí)慣操作太多
| 加強(qiáng)培訓(xùn)、提高水平
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利用工段會的機(jī)會對崗位員工進(jìn)行授課，培訓(xùn)HPL的理論及實(shí)際操作知識，使每位員工都能熟練掌握操作技能，改變習(xí)慣性操作，并符合GMP的規(guī)定，盡可能地減小操作偏差更好地服務(wù)生產(chǎn)，同時加大考核及抽檢的力度，加強(qiáng)員工的責(zé)任心，從而督促每一位員工加強(qiáng)學(xué)習(xí)，不斷提高干好本職工作。
七 對策實(shí)施：
針對檢測方法中引起偏差的原因我們計劃采用：藥典及國際通用的HPLC法檢測鹽鹽霉素含量，從而達(dá)到降低偏差、減少工作量、提高工作效率，增加數(shù)據(jù)可信度，提高產(chǎn)品質(zhì)量信譽(yù)。查閱有關(guān)資料及文獻(xiàn)，使用
**方法并對方法中的色譜條件進(jìn)行論證
1.
固定條件：
確定設(shè)備條件：（Agilend1100高效液相色譜儀）表 、L18反相色譜柱、20ml定量環(huán)
2.
色譜條件的論證（甲醇V：香草醛W：硫酸V＝95：4：0.6）流速0.6ml/min,柱溫35℃、反應(yīng)溫度100℃、檢測波長520nm。
（1）
流動相比：甲醇V：冰乙酸V：水V
制備配比為93：7：0.1、94：6：0.1、95：5：0.1、96：4：0.1、96.4：3.6：0.1、97：3：0.1六種流動相，發(fā)現(xiàn)流動相含量高時，靈敏度和峰面積都有較高的表現(xiàn)，但有沒有分開的峰，有機(jī)相低時雖然所有的峰分離效果很好，但其響應(yīng)卻低，有機(jī)相含量在95－96%時較好的分離及響應(yīng)值，選擇配比95：5：0.1做為流動相配比。
（2）流動相流速的確定：流動相配比按95：5：0.1時選拔擇流速，使用0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min七種流速發(fā)現(xiàn)流速低時響應(yīng)值及分離度都有較好的表現(xiàn)，原因是因?yàn)榱魉俚蜁r，柱的反應(yīng)能有充分的時間，但其峰形和出峰時間較差，流速高時峰形好但其響應(yīng)及分離度不好，權(quán)衡利弊，確定流速為0.8ml/min為宜
（3）衍生劑濃度的探索，流動相配比（95：5：0.1）。流速為0.8ml/min.先用四種配比，甲醇v:香草w:濃硫酸v(95 :32:0.5,95:4:0.5,95:5:0.5,95:6;0.5)，香草濃度在4%以上時響應(yīng)值和分離度較好，沒有太大的改變。而濃度低時由于反應(yīng)不會完全而響應(yīng)值不高。再提高硫酸的濃度為0.6時。響應(yīng)值更好，所以選擇了95：4：0.6。
（4）反應(yīng)池溫度的探索，
固定條件：流動相配比為（958：5：0.1）流速為0.8ml/min.衍生劑配比為95：4：0.6，選擇溫度90oc,95 oc,100 oc,105 oc,110 oc,隨著反應(yīng)池溫度的提高，響應(yīng)值有所提高，峰型不受影響，但溫度過高儀器受到的傷害較大，長期受高溫對反應(yīng)池也有腐蝕，不能長時間使用，選定100 oc時其響應(yīng)值就能滿足要求。
（5）柱溫度的探索
固定條件：流動相配比為（95：5：0.1）流速為0.8ml/min,衍生配比95：5：0.6反應(yīng)池溫度為100 oc
改變柱溫度分別為25oc,30 oc,35 oc,40 oc,45 oc,5種情況，發(fā)現(xiàn)只有出峰時間響應(yīng)值有較小改變峰型基本上不變。由于溫度過高可能導(dǎo)致固定相的長期流失引起柱效減低，故在常溫下操作即可，柱溫度確定為35 oc
（6）進(jìn)樣量的探索
固定條件：流動相配比為（95：5：0.1）流速為0.8ml/min,衍生劑（95：5：0.6）流速0.3 ml/min反應(yīng)池溫度為100 oc，柱溫度35 oc
選用20μl的定量環(huán)，進(jìn)樣濃度為1000μ/ml,800μ/ml,500μ/ml,200μ/ml,100μ/ml,150μ/ml.發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣量高時，峰的對稱性不好，有可能引起超載，大大縮短色譜柱的壽命，進(jìn)樣量太少則引起相對誤差較大，建議濃度為100μ/ml即為2μg
3最佳色譜條件的確定：
檢測波長：520nm,流動相配比甲醇V：冰乙酸V:水V=95:5:0.1,流速0.8ml/min衍生劑配比（甲醇v:香草w:濃硫酸）95：4：0.6，衍生劑流速0.6ml/min，反應(yīng)池溫度100 oc，柱溫度35 oc，進(jìn)樣量為2μg
流動相及衍生劑必須經(jīng)過脫氣防止氣泡產(chǎn)生
4 樣品提取，根據(jù)估計效價精確稱取一定量的樣品，用20ml的色譜極甲醇提取，浸泡30min ,震蕩提取30min，過濾棄去初濾液，再取1ml至10ml容量瓶中定容得100μ/ml的樣品用0.45μm的微孔濾膜過濾即可進(jìn)樣。
5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備：精確稱取50mg左右的標(biāo)準(zhǔn)品至50ml容量瓶中，用甲醇定容再分別吸取2.25ml，2.5 ml，2.75 ml的標(biāo)準(zhǔn)液至25 ml容量瓶中，即得10μ/ml，100μ/ml，110μ/ml的標(biāo)準(zhǔn)液做儲備液，用來作曲線，用外標(biāo)法測鹽霉素含量。
八 效果檢查：
1)
色普條件
C18反相色普柱（大連依利特）流動相（甲醇V：水V：冰V＝95.5：4.5：0.1），流速0.8ML/MIN,衍生劑（甲醇V：香草醛W：硫酸V＝95：4：0.6）20UL定量環(huán)，柱溫350c，反應(yīng)池溫度1000c，檢測波長7MIN左右。
2）準(zhǔn)確度
在已知含量的鹽霉素粉劑和顆粒中添加一定量的對照品，再做添加后樣品中鹽霉素的含量。算得樣品添加含量回收率如下表：
| 已知含量ug/mg
| 添加后含量ug/mg
| 回收量ug/mg
| 回收率％
| 平均回收率％
| F1
| 131.68
| 146.47
| 145.85
| 99.6
| 99.73
| F2
| 131.68
| 146.47
| 146.57
| 100.1
|
| F3
| 131.68
| 146.67
| 145.85
| 99.6
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| K1
| 125.59
| 140.46
| 140.89
| 100
| 99.49
| K2
| 125.59
| 140.66
| 139.95
| 99.5
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| K3
| 125.59
| 143.51
| 142.05
| 98.98
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線性及線性范圍
配制90u/ml, 95u/ml、 100u/ml、 110u/ml系列標(biāo)準(zhǔn)液,并利用面積作為響應(yīng)值，作曲線得Area=3.34989Amt+1.3.278,相關(guān)系數(shù)r=0.9999,說明其在1.8ug-2.2ug之間具有良好的線性。
3)
精確度
對同一批粉劑和顆粒分別作三個平行樣得結(jié)果如下表：
| 測得含量ug/mg
| 平均含量ug/mg
| RSD%
| 平均RSD%
| F1
| 131.04
| 131.68
| 0.5
| 0.6
| F2
| 132.53
|
| 0.6
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| F3
| 131.49
|
| 0.7
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| K1
| 126.95
| 125.59
| 1.1
| 0.7
| K2
| 124.72
|
| 0.7
|
| K3
| 125.11
|
| 0.4
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樣品穩(wěn)定性
對同一樣品進(jìn)行放置一段時間測量，得如下數(shù)據(jù)，說明樣品24小時之內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性：
| 2h
| 4h
| 8h
| 20h
| 24h
| A
| 309
| 308
| 308
| 307
| 307
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重現(xiàn)性
對同一樣品重復(fù)進(jìn)樣三次，所得數(shù)據(jù)如下表，說明此方法具有較好的重現(xiàn)性。
| 出峰時間
| 峰面積
| 峰高
| 峰寬
| | 7.109
| 304.0
| 27.7
| 0.1688
| | 7.125
| 304.4
| 28.0
| 0.1690
| | 7.131
| 303.0
| 27.8
| 0.1678
|
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