不同方法測定大豆脲酶活性的比較研究

胡文輝

楊奇慧   舒 璐   鐘劍鋒

摘  要

用滴定法和增值法測定了大豆粉在85℃和140℃下分別熱處理0，45，90，135，180min的脲酶活性, 并用0.2%KOH溶解法測定大豆粉在不同熱處理下的蛋白質溶解度。結果表明, 在85℃條件下，處理0-180min 大豆粉的脲酶活性和蛋白質溶解度隨著時間的延長無明顯變化，而在140℃下，大豆粉的脲酶活性和蛋白質溶解度隨著處理時間的延長顯著降低。通過測定結果的比較可見，同一樣品用滴定法和增值法測得的脲酶活性在數(shù)值上不相等, 不能互用，但蛋白質溶解度更能反映大豆粉受熱過度的程度。

關鍵詞：大豆粉；脲酶活性；蛋白質溶解度； pH增值法；滴定法

眾所周知，大豆含有較豐富的蛋白質、脂肪、碳水化合物等，是飼料生產中主要的植物蛋白源之一，具有較高營養(yǎng)價值[1]。然而，大豆中含有多種抗營養(yǎng)因子，如蛋白酶抑制因子、植物凝集素、胃腸脹氣因子、抗維生素因子、抗原蛋白等[2]。由于這些抗營養(yǎng)因子在大豆產品中具有較高的生物活性，阻礙營養(yǎng)物質在動物體內的利用[3]，尤其是胰蛋白酶抑制因子的存在不僅會降低飼料營養(yǎng)成分的消化率和適口性，且影響動物對蛋白質的消化吸收，對動物生長發(fā)育也產生不良的影響。然而，胰蛋白酶抑制因子的測定較困難，且豆粕中脲酶活性與胰蛋白酶抑制因子活性呈正相關，所以通常通過測定脲酶活性來反映蛋白酶抑制因子的活性[4]。

脲酶活性定義為：在30±0.5 ℃和pH為7的條件下，每分鐘每克大豆制品分解尿素后，所釋放氨態(tài)氮的毫克數(shù)[5]。目前，脲酶活性的測定方法有滴定法(國標法)、pH增值法，快速測定法等[5，6]。

目前，對脲酶活性不同測定方法及結果間的差異性的研究較少[7-8]，本文擬對兩種方法進行研究，以比較不同方法對測定結果的影響，為實際生產和理論研究提供數(shù)字依據(jù)和參考。

1材料和方法
1.1實驗材料大豆粉：將生大豆粉碎，過60目標準篩。在85 ℃和140 ℃下分別處理0、45、90、135和180min冷卻后裝入封口袋保存?zhèn)溆谩?/font>
1.2化學試劑

本實驗所用試劑均為分析純(AR)，實驗用水為蒸餾水。

1.3測定方法
1.3.1pH增值法

實驗原理：將研細的試樣與尿素緩沖液混合，尿素在尿素酶作用下水解產生氨，使溶液pH 值改變，改變的程度與脲酶活性大小相關，因此可以用其與空白溶液的差值表示脲酶活性高低， 單位為△pH 值。

1.3.1.1主要溶液配制（1）磷酸緩沖液：將3.403 g磷酸氫二鉀加入100 ml水中溶解；將4.335 g磷酸氫二鉀溶于100 ml水中；將兩種溶液混合，稀釋至1000 ml。用弱酸或弱堿調至pH =7.0。
（2）尿素緩沖液：將15 g尿素加入500 ml上述磷酸緩沖液中。用弱酸或弱堿調至pH =7.0。
1.3.1.2操作方法取0.200 g試樣，裝入比色管中。加入10 ml尿素緩沖液，迅速蓋上蓋子，劇烈搖動。將比色管置于30±0.5 ℃的恒溫水浴鍋中，準確保持30 min。
另稱取等量試樣放入另一支比色管中，加入10 ml磷酸緩沖液，蓋上蓋子，將試樣與緩沖液混合均勻，置于水浴鍋中保持30 min，作為空白試驗。
每隔5 min將水浴鍋中比色管中的試樣搖勻一次。
每個比色管保持30 min后，從水浴鍋中取出，倒出上清液于小燒杯中。并在從水浴鍋中取出恰好5 min時，用酸度計測出pH值。
1.3.1.3
計算公式UA= pH 1－pH 0
式中：UA——脲酶活性，△pH；
pH 1——樣品使尿素分解后的樣液pH值；
pH 0——空白樣液的pH值.

1.3.2滴定法

原理：樣品與中性尿素緩沖液混合，在( 30±0.5) ℃下保持30 min, 樣品中脲酶催化尿素水解產生氨，用過量的鹽酸中和氨，再用氫氧化鈉標準溶液回滴到溶液pH 值為4.70。脲酶活性用每克樣品在30±0.5 ℃下每分鐘產生氨態(tài)氮的毫克數(shù)表示，單位為NH3 mg/ g·min。

1.3.2.1
溶液配制（1）尿素緩沖液：將8.95 g磷酸氫二鈉和3.40 g磷酸二氫鈉溶于水中，并稀釋至1000 ml，再將30 g尿素溶于此磷酸緩沖液中。
（2）0.1 mol/L鹽酸溶液：8.3 ml鹽酸注入1000 ml水中。
（3）0.1 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4 g氫氧化鈉溶于水中，并稀釋至1000 ml。
1.3.2.2
操作方法（1）氫氧化鈉標準溶液的標定
稱取0.6 g于105~110 ℃烘至恒重的基準鄰苯二甲酸氫鉀，準確至0.0001 g，溶于50 ml水中，加2滴酚酞指示劑，用配制好的氫氧化鈉標準溶液滴定至溶液呈粉紅色。
同時做空白試驗。
（2）UA的測定
稱取0.2000 g試樣，轉入比色管中，加入10 ml尿素緩沖液，立即蓋好蓋子并劇烈搖動。置于30±0.5℃恒溫水浴上準確保持30 min后立即加入10 ml 0.1 mol/L鹽酸，迅速冷卻到20℃，將比色管內容物全部轉入燒杯，用水沖洗比色管2~3次，立即用標準氫氧化鈉溶液滴定至pH＝4.7。
另取比色管做空白試驗，加入10 ml尿素緩沖液，10 ml 0.1 mol/L鹽酸。稱取與上述試樣量相當?shù)脑嚇樱杆偌尤氡壬苤校⒓瓷w好比色管并劇烈搖動，在30±0.5℃恒溫水浴上準確保持30 min，冷卻到20℃，將比色管內容物全部轉入燒杯，用水沖洗比色管2~3次，用標準氫氧化鈉溶液滴定至pH＝4.7。
1.3.2.3
計算公式

U=14×c(V0 - V)/30×m

式中: U—— —每分鐘每克大豆制品釋放氮的毫克量表示的脲酶活性；

c —— —氫氧化鈉標準溶液的摩爾濃度(mol/l) ；

V0 —— —空白試驗消耗的標準氫氧化鈉溶液體積(ml)；

V—— —測定試樣消耗的標準氫氧化鈉溶液體積(ml) ；

m—— —試樣質量( g).

1.3.3蛋白質溶解度的測定

原理：氫氧化鉀蛋白質溶解度可以反映大豆粕產品加熱過度的情況，不同加熱程度的大豆粕，氫氧化鉀蛋白質溶解度不同。先測定大豆粕樣品在規(guī)定的條件下，可溶于氫氧化鉀溶液中的粗蛋白質含量，再測定同一大豆粕樣品中總的粗蛋白質含量，計算出氫氧化鉀蛋白質溶解度[9-11]。

1.3.3.1
操作方法稱取樣品1.5 g，置于250 ml燒杯中，用移液管移取75 ml
氫氧化鉀溶液，用磁力攪拌器攪拌20 min，再將攪拌好的溶液轉移至離心管中，以2700 r·pm
離心10 min，用移液管移取濾液15 ml,放入消化管中，用凱氏定氮法測定蛋白含量。
另稱取0.3 g樣品，按照凱氏半微量定氮法測定原料樣品中的粗蛋白含量。
1.3.3.2
計算公式蛋白質溶解度＝15 ml上清液中粗蛋白質的質量(g)/ 0.3 g試樣中粗蛋白質的質量(g)

2結果與分析
2.1  85℃下不同加工時間段大豆粉脲酶活性及蛋白質溶解度85℃下大豆粉脲酶活性及蛋白質溶解度結果見表1。由表可見， 85℃加熱0-180min的條件下，大豆粉脲酶活性及蛋白質溶解度變化不明顯。結果表明85℃下熱處理對大豆蛋白破壞作用不明顯，該溫度大豆粉中的蛋白酶抑制劑的活性不足以破壞。滴定法和增值法測得的脲酶活性大小，在數(shù)值上差異較小。

表1
85℃下大豆粉脈酶活性及蛋白質溶解度

Tab.1 The result of urease activit and protein solubility of soybean meal under 85℃

加熱時間 min	脲酶活性		蛋白質溶解度（%）
	pH增值法UA（△pH）	滴定法UA (NH3 mg/g·min)
0	2.30	2.47	82.11
45	2.22	2.43	81.05
90	2.16	2.40	80.07
135	2.08	2.38	76.84
180	2.00	2.35	75.03

2.2  140℃下不同加工時間段大豆粉脲酶活性及蛋白質溶解度

由表可見， 140℃加熱條件下，大豆粉脲酶活性及蛋白質溶解度隨加熱時間延長降低，135min時，pH增值法測定的脲酶活性為0；蛋白質溶解度從82.1%降至22.5%。表明140℃熱處理對大豆蛋白和脲酶活性破壞明顯，說明140℃熱處理可以破壞大豆粉中蛋白酶抑制劑活性，但對蛋白質品質也有不良影響。兩種方法測得的脈酶活性大小，與85℃熱處理一樣，在數(shù)值上滴定法稍大， 但與增值法無明顯區(qū)別。

表2. 140℃下大豆粉脈酶活性及蛋白質溶解度

Tab.2 The result of urease activit and protein solubility of soybean meal under 140℃

加熱時間 min	脲酶活性		蛋白質溶解度（%）
	pH增值法UA（△pH）	滴定法UA (NH3 mg/g·min)
0	2.30	2.47	82.1
45	0.15	0.20	72.5
90	0.04	0.05	53.8
135	0.00	0.02	33.7
180	0.00	0.00	24.3

3討論
3.1兩種方法對脲酶活性測定結果的比較從本實驗結果表明，雖然不同方法測定同一樣品的結果在數(shù)值上不完全等，但兩種方法所測得脲酶活性的強弱趨勢相一致。根據(jù)國家在制定大豆餅粕脲酶活性的測定方法(滴定法)時，并規(guī)定了大豆餅粕脲酶活性用此方法測得的數(shù)值不應大于0.4 NH3mg/g·min[7，12]。從表1和表2結果可見，在85℃條件下，作用0~180 min內，大豆粉的脲酶活性均未能達到國家標準。結果表明，在該條件下產品所含胰蛋白酶抑制因子的被破壞程度較低，并對大豆粉蛋白的質量影響不大。相對而言，在140℃下，作用0~180min內，大豆粉的脲酶活性已大大降低，均達到國家標準，尤其是當作用時間超過135 min后，兩種方法測定的結果顯示被測樣品中脲酶活性為0。
3.2脲酶活性與蛋白質溶解度的關系除了脲酶活性外，蛋白質溶解度是近年來判定大豆制品質量的常用指標。由于脲酶活性高低反映大豆餅粕受熱程度，可間接反映蛋白酶抑制因子活性高低，但當脲酶活性為0后，進一步加熱，脲酶活性仍為0，即此時脲酶活性不再能反映大豆餅粕的受熱程度，而蛋白質溶解度仍可隨受熱程度的增加進一步降低[13]，因此，脲酶活性主要用于評價大豆制品是否過生，在反映大豆及其制品的加工是否受熱過度方面，用蛋白質溶解度來評判更為適宜[7]。

20世紀60年代末，Rinehart首先采用0.2%氫氧化鉀測蛋白質溶解度的方法來評定大豆粕加工的適宜程度，由于該方法簡單、易學，重復性和再現(xiàn)性好，被世界各國廣泛采用[14]。Araba和Dale研究結果表明，當大豆粕的蛋白質溶解度低于70%時，很可能影響其營養(yǎng)價值，而當?shù)鞍踪|溶解度低于65%時，則肯定大豆粕已加熱過度[15-16]。近年來，隨著加工技術的不斷改進和完善，完全可以生產出蛋白質溶解度超過85%甚至達到90%，而脲酶活性接近于零的優(yōu)質大豆產品[11]。

從表1和2結果顯示，大豆粉的蛋白質溶解度隨著加工溫度的提高和作用時間的延長而下降。在140℃下，隨著作用時間的延長，大豆粉蛋白質溶解度降低更加顯著。同時，兩種方法的測定結果在數(shù)值上不能相互替代，由此可見，在對大豆餅粕脲酶活性進行表述或提出具體限量要求時，應明確測定方法，避免引起不必要的糾紛。對于鑒定豆粕質量時，脲酶活性只能判定其內非營養(yǎng)成分的鈍化程度，而對過度加熱的豆粕蛋白變性程度卻無法測定，故建議用脲酶活性與蛋白質溶解度相結合的檢測手段進行評價。

xishanzhongke

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weihua0608

怎么沒看到苯酚紅這三個字呢?

LXSLDXH0521

我們沒有離心機, 測不了氫氧化鉀溶解度

zhenjieli

看后不能光說感謝就行了，分享我的的體會：
1、該方法測脲酶活性比較簡單，大部分企業(yè)都能做的，而且相對較準；
2、脲酶活性反映胰蛋白酶抗營養(yǎng)因子的多少和大豆加工的生熟程度以及蛋白溶解度——主要是這三點。
3、一般加熱過度的豆粕脲酶活性會高，蛋白溶解度會低于65%。較好的豆粕、大豆溶解度胃80左右。