投喂益生菌對黃河鯉魚免疫效果的研究

胡文輝

殷海成 趙紅月

摘要：本試驗研究蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）對黃河鯉魚血液免疫應答強度的影響。將蘇云金芽胞桿菌按1.0×1011、3.0×1011、5.0×1011 cfu/kg三個濃度添加在魚用全價顆粒飼料中，投喂經嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）疫苗免疫(A0～3)和未免疫組(B0～3)黃河鯉魚，分別于0，15，30，40d時檢測各組鯉魚白細胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、血清凝集抗體效價，并進行攻毒試驗。結果表明：添加蘇云金芽胞桿菌均能顯著提高黃河鯉的白細胞吞噬活性和溶菌酶活性，增強黃河鯉的凝集抗體效價；各實驗組與對照組免疫應答強度差異顯著（P<0.05），免疫組免疫應答強度明顯高于未免疫組，且差異顯著（P<0.05）；蘇云金芽胞桿菌能提高黃河鯉經活菌攻毒后的存活率，其中，當菌株添加濃度為5.0×1011cfu/kg時，受免疫的鯉免疫保護率（Relative percent survival）最高。即投喂蘇云金芽胞桿菌對黃河鯉魚血液免疫應答有明顯促進作用。
關鍵詞：益生菌；黃河鯉魚；免疫
Effects of Feeding on Probiotics on the Immune Response of Cyprinus carpio in Yellow River

YIN Hai-Cheng
ZHAO Hong-Yue

Henan University of Technology,Zheng zhou 450001, China

Abstract:

To study the effect of Bacillus thuringiensis（Bt）on the immune response of Cyprinus carpio in Yellow River, the concentrations of Bacillus in test groups feed were respectively 1.0×1011, 3.0×1011, 5.0×1011cfu/kg for the fish were immunized with A.hydrophilain group (A0～3) and the fish weren’t immunized in group (B0～3), Phagocytic activity of leucocytes, lysozyme activity, agglutinating antibody titer and by challenging with live A·hydrophila were checked for 0，15,30,40days. The results showed: Feed contain different concentrations Bacillus thuringiensis all could reprove the phagocytic activity of leukocytes, lysozyme activity and reprove agglutinating antibody titer. Difference is notable between adding and contrasting groups, were immunized and weren’t immunized (P <0.05). Bacillus could reprove the survival rate of cyprinus carpio in Yellow River after challenged with live A.hydrophila. When he concerntration of Bacillus is 5.0×1011cfu/kg feed, the RPS of immunized cyprinus carpio in Yellow River is the highest.

基金項目：河南工業大學校基金 (06XJC024)

Namely feeding with the Bacillus thuringiensis having promoting an effect obviously to cyprinus carpio in Yellow River blood immunity response.

Keywords: Probiotics; Cyprinus carpio in Yellow River; Immunity

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)屬于革蘭氏陽性菌，廣泛應用于防范作物、森林、果蔬蟲害，如殺滅寄生線蟲、捻轉血矛線蟲、日本血吸蟲等，在生物防治中占有極其重要的地位（李今煜等，2008）。隨著對Bt結構功能、遺傳、工程菌構建、以及全基因組序列等深入研究，使Bt的應用前景更加廣闊。對于魚類的免疫研究，主要體現在應用中草藥、免疫多糖、肽類、益生菌制劑以及免疫增強劑等。如李清等（2005）應用小肽探討鯉魚的免疫應答，添加1%的劑量取得較好的免疫效果；Kozinska A,Guz L（2004）用脂多糖注射鯉魚，可提高其免疫力。然能否將Bt作為微生態制劑，應用于水產養殖，目前沒有報道，故值得研究。本試驗應用全價飼料添加不同劑量的Bt，研究Bt對黃河鯉魚免疫應答反應的效果，探討Bt在水產動物養殖中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 黃河鯉魚分組與免疫處理

選擇400尾體重75±0.52 g的健康黃河鯉，隨機均分8組，每組50尾，編號分別為：A0（對照組）、A1、A2、A3（含A四組在7 d和14 d分別注射A．hydrophila菌苗免疫0.2 mL/尾（1×108 cells/mL）和B0（對照組）、B1、B2、B3（含B四組未免疫），養于直徑2 m的專用箱馴養15 d，開始試驗。

免疫結束后，開始試驗。試驗期間投喂飼料成分相同，試驗組飼料中分別添加蘇云金芽胞桿菌1.0×1011、3.0×1011、5.0×1011 cfu/kg，對照組不添加。每日喂食兩次（8:00，17:00），連續30 d。之后改投相同的不含芽孢桿菌飼料。日投餌量為試驗魚體重的2.50%-4.50 %。整個試驗期間，保持微流水，24 h充氣。

1.2 飼料選擇及加工

飼料選用河南大德飼料科技開發有限公司生產的鯉魚全價配合顆粒飼料（101＃，粗蛋白34%、粗脂肪5.0%、粗纖維8.0%），粉碎后加入需要量蘇云金芽胞桿菌，充分拌勻，用小型制粒機（曲阜市應用科技研究所，93KWP-105）加工成直徑為1.5 mm的顆粒，于38 ℃下烘干，保存備用。

1.3 抗原

將嗜水氣單胞菌（A．hydrophila）接種于FWA培養基，28℃培養36 h，集菌。然后加入終濃度為0.5%的福爾馬林，28℃滅活24 h，即為福爾馬林滅活的A．hydrophila菌苗，以0.65%的滅菌生理鹽水將滅活的A．hydrophila菌苗濃度調整為1×108cells/mL作為抗原。置4℃冰箱中保存備用。

1.4 采血及處理

試驗的第0d、15d、30d、40d（停喂后的第10d）上午進行血樣采集，采用心臟和斷尾采血兩種方法。每組取10尾。取血后，將每尾魚的血液樣本分成2份，1份置室溫1h，再置冰箱內4h，以2000r/min離心15min分離血清，供檢測溶菌酶活性；另一份以肝素抗凝，供測定白細胞吞噬活性。

1.5 白細胞吞噬活性測定

將金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）接種在FWA培養基上，28℃培養36h，集菌，并用無菌生理鹽水離心洗滌2次，制成金葡菌懸液。取金葡菌懸液，加入終濃度為0.5%的福爾馬林，28℃滅活24 h，作為本試驗中的吞噬原。在0.25mL抗凝血中加入0.1mL用滅菌生理鹽水調整為1×108cells/mL的金葡球菌懸液，搖勻后置于28℃恒溫水浴鍋中，孵育1 h，每個血樣做血涂片5張，自然晾干，甲醇固定，Giemsa染色，油鏡觀察并計數。計算：吞噬百分比（PP）=（100個白細胞中參與吞噬的細胞數/100）×100；吞噬指數（PI）=被吞噬的細菌數/吞噬細菌的細胞數。

1.6 血清溶菌酶活性測定

1.6.1菌液的制備

以粉狀溶壁微球菌（micrococcus lysoleikticus）配成4×106 cfu/mL菌液，再用722型分光光度計于640 nm測定并調整其濃度，使OD640=0.3。

1.6.2溶菌酶活性的測定

取0.1 mL血清2份，一份于28 ℃水浴鍋中預熱5 min后加入1.8 mL菌液，2 min時加入2滴5 mol/L KOH溶液終止反應，測640 nm波長下透光率為T1％。另一份重復上述步驟，測透光率為T0％。T1％－T0％即溶菌酶所致透光率的變化。與標準曲線對比，查血清中溶菌酶活性。

1.7 凝集抗體效價測定

采用血凝板依常法進行。反應抗原采用F-AH。
1.8攻毒試驗

于免疫后第40d采用A．hydrophila（1×108cells/mL）對各組試驗魚進行攻毒。每組分別取供試魚20尾，經胸鰭基部注射0.2mL A．hydrophila活菌懸液。飼養觀察14d，統計各組的死亡率，依下式計算免疫保護率（relative percent survival, RPS）。

免疫保護率（RPS）=[1－（免疫組死亡率/對照組死亡率）]×100%

1.9 數據處理

試驗數據用STATISTIC6.0軟件進行統計分析，組間差異用Dunca，s多重比較，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 投喂芽孢桿菌對黃河鯉白細胞吞噬活性的影響

投喂蘇云金芽胞桿菌對受免和未免黃河鯉白細胞吞噬活性的影響見表1。

表1
投喂蘇云金芽胞桿菌對受免和未免黃河鯉白細胞吞噬活性的影響；*表示停止Bt后10d

Table1
Influence of the phagocytic activity of leukocytes of immunized Huanghe cyprinus carpio before and after feeding Bt.（Mean±SD）;* 10 d after feeding without Bt

天數 Days	吞噬活性 Phogocytic activity	組別 （Groups）
		A0 A1 A2 A3 B0 B1 B2 B3
0	PP	32.91±3.08a 31.88±2.29a 32.30±2.51a 33.12±2.44a 32.45±3.14a 31.72±1.86a 32.21±2.25a 33.41±2.51a
	PI	1.16±0.19a 1.41±0.11a 1.34±0.07a 1.36±0.19a 1.15±0.07a 1.32±0.31a 1.08±0.14a 1.12±0.30a
15	PP	38.81±3.06b 60.81±2.54c 64.67±5.12c 63.15±4.23c 32.15±3.37a 55.03±2.05c 58.48±1.58c 58.83±3.21c
	PI	1.26±0.16b 3.45±0.22c 2.60±0.11c 3.27±0.32c 1.22±0.41a 2.18±0.81c 2.35±0.15c 3.01±0.26c
30	PP	38.24±2.09b 58.67±2.15c 62.52±1.23c 60.23±4.14c 34.80±3.04a 57.28±1.05c 59.12±1.82c 58.67±3.08c
	PI	1.47±0.16b 3.02±0.11c 2.46±018c 2.45±0.25c 1.28±0.14a 3.36±0.24c 3.51±0.33c 3.74±0.24c
40*	PP	39.80±3.01b 59.62±3.44c 60.45±1.83c 61.45±2.20c 34.24±2.18a 51.48±1.42c 53.80±3.44c 52.35±3.19c
	PI	1.58±0.11b 3.96±0.34c 4.15±0.30c 4.28±0.21c 1.33±0.23a 3.44±0.23c 3.72±0.11c 3.57±0.48c

由表1可以看出，各試驗組在投喂芽孢桿菌前，PP、PI均無顯著性差異。投喂芽孢桿菌后第15 d，免疫組A1、A2、A3組的吞噬活性達到最強，分別為60.81±2.54c、3.45±0.22c，64.67±5.12c、2.60±0.11c，63.15±4.23c、3.27±0.32c，對照A0組為38.81±3.06b、1.26±0.16b，15d后，A1、A2、A3組的PP和PI雖有不同程度的下降，但仍顯著高于A0組。Dunca，s多重比較A1、A2、A3組間PP和PI無顯著性差異（P>0.05），與A0組對比差異顯著（P<0.05），A0組在投喂前后則差異顯著（P<0.05）。試驗對未受免組，芽孢桿菌也能提高黃河鯉白細胞的吞噬活性，表現和免疫組相似，但白細胞的PP和PI均低于免疫組（30d時最高）。說明投喂一定量蘇云金芽胞桿菌可提高受免黃河鯉的白細胞吞噬活性。

2.2 投喂芽孢桿菌對鯉血清溶菌酶活性的影響

投喂蘇云金芽胞桿菌對鯉魚血清溶菌酶活性的影響見表2。試驗各組在投喂蘇云金芽胞桿菌前，溶菌酶活性并無顯著性差異（P>0.05）。投喂開始之后的第15d，免疫組A1、A2、A3各組的溶菌酶活性顯著增高，且達到最高值，分別為99.87±2.12c、106.10±1.21b、100.94±1.47a。而未經免疫各組同樣增高，但增速小于免疫組。Dunca，s多重比較，A2組與A3組無顯著性差異（P>0.05），但于A1組間差異顯著（P<0.05），免疫組與未免疫組差異顯著（P<0.05）。30d之后到停止投喂，溶菌酶活性雖然稍有下降，但差異不顯著（P>0.05）。且仍顯著高于對照組（45.32 u/mL-52.80 u/mL）。由此可知：飼料中添加蘇云金芽胞桿菌可提高黃河鯉的血清溶菌酶活性，添加濃度越高效果相對越好（3.0×1011；5.0×1011
cfu/kg）。

表2
投喂蘇云金芽胞桿菌對受免和未免黃河鯉血清溶菌酶活性的影響（單位u/mL）

Table 2
Influence of the lysozyme activity in serum of immunized Huanghe cyprinus carpio before and after feeding Bt.（Mean±SD）;( u/mL)

天數 Days	組別和溶菌酶活性（Groups and lysozyme activity）
	A0 A1 A2 A3 B0 B1 B2 B3
0	45.32±1.52a 45.42±2.02a 45.82±2.07a 45.24±3.70a 44.90±2.81a 45.04±2.51a 45.22±0.23a 45.70±1.08a
15	52.32±1.41a 99.87±2.12b 106.10±1.21c 100.94±1.47c 47.84±3.64 a 78.50±1.74d 86.12±1.60d 90.54±1.84d
30	52.80±2.42a 98.92±3.51b 100.40±2.04c 99.54±2.36c 47.78±4.01a 74.48±4.82d 85.34±5.65d 88.56±4.82d
40*	52.50±1.24a 95.84±2.34b 96.52±2.03c 95.93±2.10c 47.94±2.59a 68.51±3.30d 65.47±1.87d 66.30±3.81d

*表示停止投喂芽孢桿菌后10d ; * 10 d after feeding without Bt

2.3 投喂蘇云金芽胞桿菌對黃河鯉凝集抗體效價的影響

免疫組（A0、A1、A2、A3）的凝集抗體效價隨投喂天數逐漸上升，在30d時達到最高值。以A2組凝集抗體效價最高，達1:120.56，其次為A3為1:119.40，二者近似相等；A0組最低為1:101.32。投喂濃度高（5.0×1011 cfu/kg），所獲得的凝集抗體效價也高。而未免疫組（B0、B1、B2、B3）的凝集抗體效價在整個試驗期內處于1:＜4-8之間，明顯低于免疫組。說明投喂蘇云金芽胞桿菌能提高受免黃河鯉的凝集抗體效價（見表3）。

表3
投喂蘇云金芽胞桿菌后黃河鯉凝集抗體效價的變化

Table 3
Agglutination antibody titer of Huanghe cyprinus carpio before and after feeding Bt

組別group	天數和凝集抗體效價 days and agglutination antibody titer
	0 15 30 40*
A0 1:＜4 1，(＜4)2 1:16-256(82.50) 1:64-256(101.32) 1:32-256(90.61)
A1 1:＜4，(＜4) 1:64-256(89.61) 1:64-256(111.09) 1:64-256(104.06)
A2 1:＜4，(＜4) 1:64-256(95.74) 1:128-512(120. 56) 1:64-256(111.02)
A3 1:＜4，(＜4) 1:64-256(98.01) 1:128-512(119.40) 1:64-256(106.75)
B0 1:＜4，(＜4) 1:＜4-8 (4.01) 1:＜4--8(4.75) 1:＜4-8(4.20)
B1 1:＜4，(＜4) 1:＜4-8 (4.90) 1:＜4-8(5.21) 1:＜4-8(4.38)
B2 1:＜4，(＜4) 1:＜4-8(5.01) 1:＜4-8(5.32) 1:＜4-8(4.21)
B3 1:＜4，(＜4) 1:＜4-8(4.98) 1:＜4-8(5.17) 1:＜4-8(4.73)

*表示停止投喂芽孢桿菌后10d；1 表示凝集抗體效價的范圍；2 表示凝集抗體效價的幾何平均數

*10 d after feeding without Bt;1 indicate spectrum of agglutination antibody titer;2 indicate geometric mean of agglutination antibody titer

2.4 攻毒后的存活率

各組魚經活菌攻毒后，死亡情況見表4。從表5可以看出，經過免疫接種后的鯉魚均獲得了一定的免疫保護率，且蘇云金芽胞桿菌能提高受免鯉魚的存活率。當蘇云金芽胞桿菌在飼料中的添加濃度為5.0×1011cfu/kg飼料時，受免鯉魚獲得了最高的免疫保護率（>70%）。而未免疫組攻毒試驗結果，其死亡率大于60%。

表4 活菌攻毒后鯉的死亡率和免疫保護率

Table4 Mortality and relative percent survival of the experiment and control Cyprinus carpio after challenged with live A.hydrophila

組別 groups	攻毒魚尾數 No. of fish challenged	死亡魚尾數 No. of dead fish	死亡率 Mortality（％）	免疫保護率 RPS(%)
A0	20	15	75	16.67
B0	20	18	90
A1	20	11	55	31.25
B1	20	16	80
A2	20	5	25	61.54
B2	20	13	65
A5	20	3	15	75.00
B3	20	12	60

3 討論

3.1蘇云金芽胞桿菌對黃河鯉魚白細胞吞噬活性、溶菌酶活性的影響

近年來，微生態制劑在畜禽飼料中應用較多，主要能提高其免疫應答能力，但在水產動物飼料以及預防疫病研究較少。在本試驗應用蘇云金芽胞桿菌投喂黃河鯉魚，觀察鯉魚的血液免疫應答能力，效果明顯。
這與劉克林、何明清（2000）用益生菌對鯉魚免疫功能影響研究結果一致；同時證實蠟樣芽孢桿菌對肉雞血中L細胞值有明顯提高。溫俊、孫東巖（2008）應用合生素對鯉魚抗病力研究，取得較好的保護率。陳昌福（1998）利用細菌脂多糖對鯉魚淋巴細胞培養結果也表明有明顯的激活作用，使淋巴細胞數量的增強。溶菌酶是動物非特異性免疫物質之一，在動物防御機制中同樣起著重要作用。王宏田等（2000）、王雄等（2004）報道微生態制劑對水產動物溶菌酶活性有增強作用。Marja和Antti（1992）研究表明，在一定程度上，血漿中的溶菌酶水平變化是與循環系統中的白細胞數目變化是一致的。本實驗研究結果，添加蘇云金芽胞桿菌顯著提高鯉魚血液中細胞吞噬活性、溶菌酶活性以及免疫保護力。其中當芽孢桿菌濃度為5.0×1011cfu/kg時效果最為明顯。

3.2 蘇云金芽胞桿菌對黃河鯉凝集抗體效價及免疫效果的影響

高等動物通過檢測抗體和依據抗體滴度反映免疫應答水平。Inooka和Kimura（1983）報道用納豆芽孢桿菌飼喂雛雞后，能夠增強雛雞對抗綿羊紅細胞的凝集抗體的產生；盧勝明（2002）報道益生芽孢桿菌制劑能顯著提高雛雞的新城疫血凝抑制效價，對雛雞具有免疫調節作用。但關于微生態制劑對魚類凝集抗體效價的作用的報道并不多見。楊先樂等（1990）研究草魚出血病發現免疫保護力較高時，血清中抗體水平也較高。從本試驗研究發現，受免疫鯉的血清凝集抗體效價隨著芽孢桿菌濃度的增加而升高。在4個免疫組中，第30d時，A2組凝集抗體效價最高，平均為1:120.56，其次是A3組，平均凝集抗體效價為1:119.40，這說明芽孢桿菌可以提高鯉的特異性免疫機能。但也有文獻報道免疫保護力與血清中抗體水平不一致的現象。Toranzo等（1995）用腸球菌的二價疫苗免疫鱒魚，血清凝集抗體效價非常低，但對攻毒表現了良好的免疫保護效果。這種現象被認為可能是受免疫魚類對菌苗的免疫應答中，所產生的特異性抗體不全是保護性抗體的緣故。

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其實益生菌在很多動物上都做過試驗，而且專家的數據還都不錯，但是關鍵在于實際生產的效果啊