沉淀法測定飼料真蛋白質條件的優化

麥海因 · 發表于 2009-7-20 09:26:53

武英利

農業部畜禽產品質量安全監督檢驗測試中心（石家莊）

摘要：本文就沉淀法測定飼料中真蛋白質的各種條件進行了探索，并就其適用性進行了試驗驗證。試驗結果表明，沉淀法測定飼料中真蛋白質的最適宜條件為：試樣粉碎粒度0.5mm、試樣重量以0.5～1g、試液煮沸時間30min，氫氧化鈉溶液和硫酸銅溶液用量均為20mL，沉淀洗滌用水溫度80℃以上，氫氧化鈉和硫酸銅溶液以分次交替加入方式為佳；本試驗方法能夠排除人為因素添加入飼料中的硫酸銨、尿素、三聚氰胺等非蛋白氮物質的干擾，適用于各種不同類型的飼料真蛋白質測定。

關鍵詞：真蛋白質；粗蛋白質；測定條件

真蛋白質的概念是針對粗蛋白質而提出的，《飼料工業通用術語》（GB 10647—1989）中粗蛋白質的定義是“試樣中的氮量乘以6.25”[1]，其中的氮量包括非蛋白氮成分，一般不為動物消化利用。我們通常所說的真蛋白質即試樣中的蛋白氮部分乘以6.25，其實就是蛋白質；之所以提出真蛋白質的概念是因為隨著時間的推移，粗蛋白質已經不能準確地反映飼料產品的品質，當前世人普遍關注的三聚氰胺事件恰恰說明了這一點，而真蛋白質則比粗蛋白質能夠準確地反映飼料的品質。
目前，國內尚無飼料中真蛋白質測定的標準方法，沉淀法是測定飼料中真蛋白質常見的方法。其原理是根據蛋白質的性質利用物理化學的方法使試樣中的蛋白質溶解、變性凝結而形成沉淀，除去非蛋白氮物質[3]，通過凱氏定氮的方法測定沉淀中的含氮量，再乘以換算系數得出蛋白質含量[2]。沉淀法測定飼料中的真蛋白質的方法由來已久，但方法并不成熟，存在有許多缺陷。本文就沉淀法測定飼料中真蛋白質的各種條件進行試驗研究，以期找出真蛋白質測定的最佳條件，為進一步建立標準的檢測方法提供依據。
1.試驗材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1試驗樣品

豬配合飼料，確證沒有添加非蛋白氮類物質。
試樣處理
采取“四分法”取三份試樣按不同粒度要求進行粉碎，試樣粒度分別為0.25mm（4#）、0.50mm（5#）和0.75mm（6#）。
1.1.2主要化學試劑及溶液
1.1.2.1試劑

所用試劑未加說明均為分析純試劑；
氫氧化鈉，五水硫酸銅，硫酸（不含氮），無水硫酸鈉，硼酸，甲基紅，溴甲酚綠，乙醇，鹽酸。
1.1.2.2溶液

所用溶液未加說明均為水溶液（W/V）；
2.5%的氫氧化鈉溶液，40%的氫氧化鈉溶液，1%的硼酸溶液；
10%的硫酸銅溶液
稱取五水硫酸銅10g加水溶解定容至100mL，混勻即可；
混合催化劑
6g無水硫酸鈉、0.4g五水硫酸銅研細混勻即可；
混合指示劑
甲基紅0.1%的乙醇溶液7mL，溴甲酚綠0.1%的乙醇溶液10mL，兩者混合后加入1000mL1%硼酸溶液中即可；
0.1mol/L的鹽酸標準溶液
按照GB622要求制備并標定。
1.2主要儀器設備

粉碎機（德國Retsh公司 ZM100 篩孔0.25mm、0.50mm、0.75mm）、電子天平
感量0.0001g、可控溫電爐、可控溫干燥箱、全自動定氮儀（丹麥 FOSS公司 Kjeltec 2300）、燒杯、玻璃棒、刻度吸管、三角漏斗、中速定量濾紙。
1.3試驗方法
1.3.1
稱取試樣1g（精確至0.0002g）置250ml燒杯中，加水75ml煮沸，邊煮邊攪拌并不時加水使溶液體積不少于75ml，保持沸騰30分鐘。稍冷，慢慢滴加2.5%的氫氧化鈉溶液2ml邊加邊攪拌，再慢慢滴加10%的硫酸銅溶液5ml邊加邊攪拌；重復上述過程三次，每次加氫氧化鈉和硫酸銅溶液5～6ml，三次共計氫氧化鈉溶液18ml，硫酸銅溶液15ml。靜置陳化2小時以上或過夜[4]。
1.3.2
沉淀用中速定量濾紙采用傾瀉法過濾，用70℃以上熱水洗滌沉淀7-8次，直至用氯化鋇溶液檢驗無硫酸根離子為止（接濾液數毫升，加鹽酸數滴，然后，加5%的氯化鋇溶液2ml，無渾濁和沉淀產生）；沉淀連同濾紙置75℃干燥箱中干燥1小時[4]。
1.3. 3
干燥后的沉淀連同濾紙一起放入消化管中,加入15ml濃硫酸，6.4g混合催化劑，按照GB/T 6432《飼料中粗蛋白測定方法》—— 凱氏定氮法進行消解、蒸餾、測定其含氮量，然后，將結果乘以6.25即為試樣的真蛋白質含量；同時做空白試驗[4]。

本實驗方法是在山東農業大學王俊峰撰寫的《飼料中真蛋白質含量的測定方法》和總結實踐經驗的基礎上制定的，原方法在沉淀洗滌過程中存在一定缺陷，試驗的成功率很低。筆者通過大量試驗摸索出分次交替加入氫氧化鈉和硫酸銅溶液的方法，加快了沉淀的洗滌過程，大大提高了試驗成功率，是沉淀法測定飼料中真蛋白質的最佳方式。
2.試驗結果與分析

2.1試驗樣品的均勻性檢驗
試驗樣品的均勻性決定實驗的成功與失敗，為了檢驗試樣的均勻程度，按照GB/T 6432《飼料中粗蛋白測定方法》分別對4#、5#、6#試樣進行粗蛋白質測定，測定結果（以干物質計）見表一。
表一：試驗樣品粗蛋白含量

試樣編號	4#	5#	6#
粒度mm	0.25	0.50	0.75
粗蛋白質 %	20.91	20.95	20.99
相對偏差 %	0.2	0	0.2

從表一看來，4#、5#、6#試樣之間的粗蛋白質測定結果相差很小，遠遠低于方法標準規定的2%分析允許誤差，平均粗蛋白質含量為20.95%。說明試驗樣品混合均勻，4#、5#、6#樣品均勻一致沒有明顯的差異。
2.2不同試驗條件對結果的影響
2.2.1試樣粉碎粒度對測定結果的影響
為了測試試樣粒度對真蛋白質測定的影響，依法對不同粒度的4#、5#、6#樣品進行真蛋白質測定，測定結果（以干物質計）見表二。
表二：粒度對測量結果的影響

試樣編號	4#	5#	6#
試樣粒度mm	0.25	0.50	0.75
真蛋白質 %	19.80	19.73	19.77
相對偏差 %	0.2	0.2	0.0

由表二可知，三個粒度試樣的平均真蛋白質含量為19.77%，其測定結果的分析誤差均在GB/T 6432《飼料中粗蛋白測定方法》規定的2%允許誤差范圍之內。結果表明，粒度在0.25～0.75mm之間測試結果沒明顯差異。考慮到樣品處理和沉淀洗滌等方面因素，筆者認為試樣粉碎粒度以0.5mm為宜。
2.2.2試樣重量對測定結果的影響
為了研究樣品重量對真蛋白質測定結果的影響，在其它條件不變的情況下，依法測定不同重量條件下6#樣品的真蛋白質，測定結果（以干物質計）見表三。
表三：試樣重對結果的影響

試樣重量g	0.25	0.50	1.00	2.00
真蛋白質 %	19.90	19.75	19.72	19.75
相對偏差 %	0.6	0.2	0.3	0.2

從表三來看，試樣重量為0.25g時，測試結果較其他三個重量結果明顯偏高，但其他三個重量結果沒有明顯差異。而這個結果（19.90%）與最低結果（19.72%）比較仍在GB/T 6432《飼料中粗蛋白測定方法》規定的2%的允許相對偏差范圍之內。表明試樣重量在0.25～2g之間對測試結果影響不大。考慮到分析誤差、標準滴定溶液消耗等方面因素，筆者認為試樣重量以0.5～1g為宜。
2.2.3 氫氧化鈉溶液用量對測定結果的影響
氫氧化鈉溶液在試驗中的作用，一方面有助于試樣中的蛋白質溶出，另一方面為蛋白質變性凝結提供堿性環境，那么，氫氧化鈉的多少是否會對試驗結果造成影響呢？在其他條件不變的情況下，使用不同體積的氫氧化鈉溶液條件依法對5#樣品進行測定，測定結果（以干物質計）見表四。
表四：氫氧化鈉溶液用量對結果的影響

氫氧化鈉ml	18	20	23	25
真蛋白質 %	19.63	19.77	19.95	19.38
相對偏差 %	0.8	0.1	0.9	——

從表四看來，隨著氫氧化鈉溶液使用量的增加，試樣的真蛋白質測定結果增加到一定程度后就不再增加反而降低，但18mL、20mL、23mL三個不同使用量的測定結果相差不大，其分析誤差均在GB/T 6432《飼料中粗蛋白測定方法》規定的2%允許相對偏差范圍之內。表明氫氧化鈉溶液使用量雖然對測定結果有一定影響，但影響不大可以忽略。試驗中我們還發現，隨著氫氧化鈉溶液用量的增加，沉淀洗滌時過濾的速度逐漸下降，這可能與硫酸銅的相對量不足有關。考慮到分析方法的實用性和可操作性，筆者認為選擇20mL的氫氧化鈉溶液用量比較理想。
2.2.4硫酸銅溶液用量對結果的影響
硫酸銅在試驗中為蛋白質變性提供重金屬離子，在反應中起重要作用。為了探索硫酸銅溶液使用量對測定結果的影響，在其它條件不變的前提下，選擇不同體積的硫酸銅溶液使用量依法對5#樣進行測定，測定結果（以干物質計）見表五。
表五：硫酸銅溶液用量對結果的影響

硫酸銅量 ml	18	20	23	25
真蛋白質 %	19.88	19.77	19.64	19.53
相對偏差 %	0.9	0.4	0.3	0.9

表五結果顯示，隨著硫酸銅溶液使用量增加，試樣真蛋白質測定結果呈下降趨勢，同時還發現隨著硫酸銅用量增加，洗滌時過濾速度有所加快。同樣就分析誤差來講，四個不同體積的硫酸銅溶液的測定結果均在GB/T 6432《飼料中粗蛋白測定方法》規定的2%允許相對偏差范圍之內。說明硫酸銅溶液的使用量雖然對測定結果有一定影響，但影響并不大。從分析方法的實用性和可操作性角度出發，筆者認為，選擇20mL的硫酸銅溶液用量比較適宜。
2.2.5試樣煮沸時間對測定結果的影響
煮沸是為了促進試樣中的蛋白質溶解。為了研究試樣煮沸時間對真蛋白質測定結果的影響，在其他條件不變的情況下，選取20min、30min和40min三個時間段依法對6#樣品進行測定，測定結果（以干物質計）見表六。
表六：煮沸時間對結果的影響

煮沸時間min	20	30	40
真蛋白質 %	19.66	19.72	19.51
相對偏差 %	0.2	0.5	0.6

從表六可以看出，試樣的煮沸時間對測定結果有一定的影響，但影響不大，分析誤差在GB/T 6432《飼料中粗蛋白測定方法》規定的誤差范圍之內，當煮沸時間為30min時測定結果最高，因此，試樣煮沸時間以30min為宜。
2.2.6
沉淀洗滌溫度對測定結果的影響
洗滌是為了除去試樣中的非蛋白氮成分，是試驗的關鍵步驟。為了了解沉淀洗滌溫度對測定結果的影響，在其他條件不變的情況下，使用不同的洗滌溫度依法對4#樣品進行測定，測定結果（以干物質計）見表七。

表七洗滌溫度對測定結果的影響

洗滌溫度℃	60-70	70-80	80以上
真蛋白質 %	19.76	19.77	19.84
相對偏差 %	0.2	0.1	0.3

從表七測試結果來看，三個溫度段的測定結果均在GB/T 6432《飼料中粗蛋白測定方法》規定的2%分析誤差范圍之內，而且結果基本一致，也就是說洗滌溫度對測定結果影響不大。但試驗中發現洗滌用水的溫度在80℃以上時沉淀洗滌速度明顯快于其他兩個溫度段。因此，洗滌用水溫度選擇80℃以上較為合適。
2.3驗證試驗
為了驗證試驗方法的可行性和可靠性，檢驗人為添加非蛋白氮物質條件下本試驗方法的適用性，我們組織了非蛋白氮物質添加試驗。添加物分別為硫酸銨、尿素和目前大家普遍關注的三聚氰胺等，試驗結果如下：
2.3.1硫酸銨對測定結果的影響，
為了檢驗在添加硫酸銨條件下本試驗方法的適用性，以5#樣為基礎添加硫酸銨，硫酸銨添加量為1.5021%，硫酸銨的含氮量為21.19%，添加后試樣增加粗蛋白質1.7%，按照GB/T 6432《飼料中粗蛋白測定方法》和本試驗方法分別對其進行粗蛋白質和真蛋白質測定，相關數據和測定結果見表八。
表八：硫酸銨添加試驗結果

測定項目	原樣	添加樣
測定項目	原樣	理論值	測定值	相對誤差
粗蛋白質%	18.73	20.43	20.24	0.9%
真蛋白質%	17.64	17.38	17.11	1.3%

從表八可以看出，無論是粗蛋白質還是真蛋白質的測定結果其相對誤差均小于2.0%，與理論值基本一致。表明在試樣中添加硫酸銨不會影響試樣真蛋白質測定結果，也就是說本試驗方法可以避免硫酸銨的干擾，適合于含有硫酸銨的飼料產品測定。
2.3.2添加尿素對測定結果的影響，
為了檢驗尿素對試樣中真蛋白質測定的影響，以4#樣為基礎進行尿素添加試驗，尿素添加量為1.8035%，尿素含氮量為46.6%，添加后粗蛋白質增加4.76%，按照GB/T 6432《飼料中粗蛋白測定方法》和本試驗方法分別對其進行粗蛋白質和真蛋白質測定，相關數據和測定結果見表九。

表九：尿素添加試驗結果

測定項目	原樣	添加樣
測定項目	原樣	理論值	測定值	相對誤差
粗蛋白質%	18.86	23.62	23.59	0.1%
真蛋白質%	17.86	17.53	17.24	1.7%

由表九可知，添加尿素后其粗蛋白測定值相對于理論值的誤差均小于2.0%，真蛋白質測定結果接近理論值，稍微偏低。表明在試樣中添加尿素不會干擾試樣中真蛋白質的測定；說明本試驗方法適用于添加了尿素的飼料產品測定。
2.3.3添加三聚氰胺對測定結果的影響，
為了驗證試樣中添加的三聚氰胺是否對真蛋白質測定造成影響，以4#樣為基礎進行三聚氰胺添加試驗，三聚氰胺添加量為0.4813%，三聚氰胺的含氮量為66.6%，添加三聚氰胺后試樣的粗蛋白質增加1.91%，按照GB/T 6432《飼料中粗蛋白測定方法》和本試驗方法分別對其進行粗蛋白質和真蛋白質測定，相關數據和測定結果見表十。
表十：三聚氰胺添加試驗結果

測定項目	原樣	添加樣
測定項目	原樣	理論值	測定值	相對誤差
粗蛋白質%	18.81	20.72	20.85	0.6%
真蛋白質%	17.92	17.83	17.87	0.2%

從表十可以看出，添加三聚氰胺后試樣的粗蛋白質和真蛋白質測定結果與理論值非常接近。這說明本試驗方法適用于添加了三聚氰胺的飼料產品的測定，三聚氰胺不會干擾真蛋白質的測定結果。
2.3.4不同類型飼料的真蛋白質測定
為了驗證本試驗方法對不同類型飼料真蛋白質測定的適用性，選取配合飼料、濃縮飼料、豆粕、棉粕、進口魚粉和國產魚粉，按照GB/T 6432《飼料中粗蛋白測定方法》和本試驗方法分別對其進行粗蛋白質和真蛋白質測定，測定結果見表十一。
表十一
不同種類飼料的真蛋白質測定結果

飼料種類	配合飼料☆	豬濃縮料	豆粕☆
粗蛋白質%	20.95	40.58	52.91
真蛋白質%	19.73	36.72	51.57
飼料種類	進口魚粉☆	國產魚粉※	棉粕☆
粗蛋白質%	64.19	63.73	39.43
真蛋白質%	57.27	53.20	38.12

注：※三聚氰胺檢測陽性；☆三聚氰胺檢測陰性。
從表十一結果可以看出，配合飼料、豆粕、棉粕三聚氰胺檢測陰性，粗蛋白質和真蛋白質測定結果相差不大；國產魚粉三聚氰胺檢出陽性，真蛋白質和粗蛋白質測定結果相差超過10%，說明三聚氰胺不會干擾真蛋白質測定。進口魚粉雖然三聚氰胺檢測陰性，但粗蛋白質和真蛋白質測定結果相差也很大，分析其原因可能與魚粉的新鮮程度和腐敗程度有關，但也不排除其他因素。試驗結果表明，本試驗方法適用于不同類型的飼料真蛋白質測定，而且，本試驗方法能夠區別飼料中是否含有非蛋白氮成分。
3.結論
3.1
在沉淀法測定飼料中真蛋白質的過程中，氫氧化鈉和硫酸銅溶液的加入順序、使用量直接影響真蛋白質測定過程和結果，分次交替加入氫氧化鈉和硫酸銅溶液的方法是沉淀法測定真蛋白質最佳選擇。
3.2
沉淀法測定飼料中真蛋白質的最適宜條件為試樣粉碎粒度0.5mm、試樣重量以0.5～1g、試液煮沸時間30min，氫氧化鈉溶液和硫酸銅溶液用量均為20mL，沉淀洗滌用水溫度80℃以上。
3.3
本試驗方法能夠排除非蛋白氮對飼料中真蛋白質測定的干擾，適用于含有硫酸銨、尿素和三聚氰胺等非蛋白氮物質的飼料真蛋白質檢測。
3.4
本試驗方法適用于配合飼料、濃縮飼料、豆粕、棉粕、魚粉等各種類型的飼料真蛋白質檢測。

參考文獻：

[1]
中華人民共和國國家標準《飼料工業通用術語》（GB 10647—1989）.

[2] 中華人民共和國國家標準《飼料中粗蛋白質測定方法》（GB/T6432—1994）.

[3]
李靖靖等,《有機化學》 “十一五”國家規劃教材，化學工業出版社 .

[4]
王俊鋒 ,《飼料中真蛋白質含量的測定方法》《廣東飼料》第十三卷第六期，2004年12月.