【轉帖】豬細小病毒的介紹

嗷嗷乖乖

豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是一類小DNA病毒，是引起豬繁殖障礙的主要病原之一，其危害主要表現為受感染的母豬，特別是初產母豬及血清學陰性經產母豬發生流產、不孕、產死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等。該病毒對理化因素有很強的抵抗力，廣泛分布于世界各地并在大多數豬場呈地方性流行，嚴重地影響著養豬業的發展，該病的嚴重危害受到了國內外許多學者的關注，對PPV診斷方法及免疫防制的研究成為了熱點之一。

豬細小病毒感染可依據臨床癥狀和流行病學作出初步診斷，一般認為，如果僅妊娠豬發生流產、死胎、木乃伊胎、胎兒發育異常，同時有證據表明是傳染性疾病時，則應考慮到PPV感染的可能，但進一步確診必須進行實驗室診斷。自1967年，Cartwright等首次報道PPV病以來，有關該病診斷方法的研究報告較多，從最初的病毒分離鑒定，到血凝及血凝抑制試驗、酶聯免疫吸附試驗等免疫學方法，直到核酸探針、聚合酶鏈式反應等分子生物學技術應用到PPV病的診斷中。

病毒分離和鑒定用于診斷PPV感染的最大優點是結果準確可靠，可以作為最后確診。用于分離PPV的病料，一般為流產或死產胎兒的腦、腎、肝、肺、睪丸、胎盤及腸系膜淋巴結等，其中以腸系膜淋巴結和肝臟的分離率最高。。雖然此方法是最準確的診斷方法，但是其費時費力，并且需要一定的技術條件和設備，另外，其感染力會隨著胎兒死亡時間而降低從而限制了臨床應用；紅細胞凝集試驗(HA)操作簡便易行，且能進行快速、大量的診斷，但是其靈敏度低、特異性不強，只能作為輔助診斷方法。

血凝抑制(HI)試驗是檢測PPV抗體最常用的經典方法，一般采用試管法和微量法。利用HI試驗檢測人工感染PPV的豬，發現感染后5d即可檢測到相應抗體，12~14d 抗體滴度高達1024~4096，并能持續多年檢出抗體。待檢血清進行HI試驗時需要首先進行熱滅活處理，然后再用紅細胞吸附，以除去血清中的非特異性血凝素，進一步用高嶺土吸附以除去或減少血清中非特異性抑制因子。目前，該方法在國內外已得到廣泛應用。血清中和試驗(SN)也是檢測PPV抗體的方法之一，其原理是利用被檢血清的抗體中和PPV，然后根據培養細胞的病變情況來計算血清抗體的滴度。SN的特異性比HI高，但是SN的操作較為復雜，首先要進行病毒感染力的測定，而PPV在低劑量時并不引起細胞病變，從而限制了該方法的使用。1988年，Hohdatsu等率先建立了PPV的ELISA診斷方法并用于檢測PPV的血清抗體，我國姜永厚等(1997)建立了雙抗體夾心ELISA用于檢測PPV的抗原，可建立的ELISA診斷方法非特異性較強。邵振華、田海燕(中國獸藥監察所)用濾紙采集豬血樣，加入到預先用PPV抗原處理的微孔板小孔內，進行免疫間接過氧化物酶染色試驗檢測PPV抗體，在2-3h內即可觀察結果。對比試驗證實比HI敏感(高7.4%)，特異性更強。就操作過程而言，該方法比HI要簡單，且具有采血方式新穎、送樣方便以及抗原軟板可隨意剪取、不需要特殊的儀器設備等優點，但該方法中抗原的保存時間有限，因此限制了該方法的普及應用。王川慶(1996)等利用對流免疫電泳技術檢測PPV抗原和抗體，在pH8.6、離子濃度為0.1mol/L、電流4mA的條件下，1~2h便可得出結果，而且抗原和血清不需做特殊處理，使用的是普通電泳儀和常規試劑，因此有一定的推廣價值，但是與HA或HI相比，其敏感度偏低。何啟蓋等(1999)將在IBRS-2細胞上同步培養增殖的PPV經甲醛滅活后，用經硫酸銨沉淀、透析濃縮后的病毒液致敏乳膠建立了檢測PPV抗體的乳膠凝集試驗診斷方法。致敏的乳膠抗原與PPV陽性血清反應出現肉眼可見的凝集顆粒，而且與生理鹽水、PBS、犢牛血清、豬瘟、衣原體、口蹄疫、偽狂犬病、弓形蟲病及萎縮性鼻炎等陽性血清不出現凝集現象。用LAT和HI同時對203份血清進行檢測，結果發現二者的陽性符合率為93.16%。乳膠凝集試驗與HI相比，具有簡便、快速、經濟等優點，尤其適合于臨床上的現場檢測，被許多學者譽為“傻瓜技術”，因此具有良好的推廣應用前景。該方法的不足之處在于它所檢測的抗體主要是IgM，因此只能用于疾病的定性診斷，不能進行血清抗體滴度的監測。Rivera等(1986)利用固相免疫熒光技術(IBA)檢測PPV的抗原和抗體獲得成功，其具有特異、敏感、快速、檢出率高的特點，是實驗室進行病毒分離鑒定常用的方法。

單克隆抗體具有特異性強，效價高并可在體外大量制備等特點，已成功地用于許多疾病的診斷和治療。Mengeling等1984年就研制出PPV的McAb并用于臨床診斷。國內俞太尉和丘惠深(1993)用PPV7909株免疫Balb/c小鼠，融合其脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞，篩選出4株分泌抗PPV單克隆抗體的雜交瘤細胞系(F1、E6、G9、D4)，用D4株分泌的單克隆抗體建立的ELISA和HI同時對70份血清進行檢測，陽性符合率為97.5%。但二者相比，因該ELISA具有從加樣到結果判定均可自動化，不需對被檢血清進行處理，樣本容量大等特點而更適合于PPV病的早期診斷和流行病學調查。而核酸探針技術是一種分子水平的檢測技術，具有快速、敏感、特異性強等特點，特別適用于疾病的早期診斷和類癥鑒別診斷，是近二十年來應用較多的一項診斷技術。Krell等(1988)率先將核酸探針技術應用于PPV的診斷，他們將以PPV RF DNA酶切得來的3.0kb的DNA片段用放射性同位素標記后作為探針通過打點雜交檢測培養細胞中的PPV。結果發現最低可檢測0.1pg DNA。與HA的比較結果表明，該方法比HA敏感100倍以上。國內吳保成等(1992)對PPV RF DNA的Hind III和Pst I片段，進行生物素標記后用作探針進行斑點雜交。結果發現，該探針能檢測到約100pg的PPV DNA。侯喜林等(1997)同樣利用PPV DNA的Hind III和Pst I片段進行地高辛標記后用作探針檢測PPV DNA，結果能與其自行分離的7株PPV毒株的DNA雜交，最低檢出限量為40pg DNA。之后，他們又將該探針用于臨床檢測PPV感染獲得成功(侯喜林等，1998)。地高辛標記探針與放射性標記探針相比具有相同的敏感性，并且克服了生物素標記探針敏感性差、背景深的特點，因此是探針標記中較為理想的方法。核酸探針技術用于PPV抗原的檢測比HA試驗敏感、特異性強，適宜于實驗室進行PPV感染的診斷，但該方法的技術含量高，只能在專業實驗室應用，不適合大面積臨床診斷和現場應用。

1985年，美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室Mullis等人發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈式反應（PCR），使人們夢寐以求的體外大量擴增核酸片段的愿望成為現實。之后，該技術應用到了疾病診斷方法中。Moliter等(1991)根據PPV基因組序列設計了一對引物，擴增VP2基因中158bp的片段，利用酶切和探針雜交證實了擴增產物的特異性，同時對四株PPV及CPV、PRV的擴增結果進一步證實了PCR反應的特異性，該方法至少可以檢出100fg的PPV DNA，相當于1 PFU的PPV量。國內，趙俊龍等利用擴增PPV VP2基因中的445bp片段，使PCR診斷結果更易于判讀，同時建立了PPV和PRV二聯診斷方法。

綜上所述，用于PPV感染的診斷方法很多，各種方法具有不同的優缺點，相對而言，目前應用較多的是HA和HI試驗，這兩種方法基本能滿足常規的病原檢測和血清流行病學調查等需要。要得到病原學的確診，則最好利用病毒分離鑒定方法，這時免疫熒光技術經常成為首選。其它血清學診斷方法則根據不同的實驗室條件和情況選擇應用。毋庸諱言，核酸探針和PCR診斷技術的應用將會越來越廣，這兩項技術尤其是PCR技術則是所有診斷技術中靈敏度最高的診斷方法。

PPV感染目前還沒有有效的治療方法，同其它許多病毒病的防制一樣，該病也主要以免疫預防為主，由于PPV血清型單一及其高免疫原性，使得疫苗接種成為控制PPV感染的一種行之有效的方法,就其疫苗研究進展綜述如下：

1 弱毒疫苗 最早發現和應用于臨床的是PPV NADL-2弱毒株，該毒株是將PPV強毒在實驗室利用細胞培養連續傳代50次以上致弱的,分子生物學研究證實，該毒株的基因組比強毒株PPV NADL-8在VP2基因上少300bp。臨床實驗證實，血清學陰性的懷孕母豬口服或鼻內接種NADL-2株，盡管有病毒血癥存在，卻不引起胎兒感染；若將該毒株經子宮內接種，可引起胎兒感染，從而導致繁殖障礙。日本學者Fujisakl等將PPV野毒在豬腎細胞上低溫(30°C)連續傳54代，產生了HT變異株，該毒株接種豬后不產生病毒血癥，但能誘導產生高滴度的抗體和較強的免疫力。在此基礎上，Akihiro等將HＴ株在豬腎細胞上培養并用紫外線照射后傳代，獲得了安全性更好的HT-SK-C株，利用該毒株生產的弱毒疫苗已在日本商品化。我國學者對PPV弱毒苗也進行了研究，蔣玉雯等從廣西初產母豬所產死胎臟器中，分離出一株PPV自然弱毒株。用該毒株接種PPV HI抗體陰性的4月齡豬和懷孕14-23天的后備母豬，結果不產生病毒血癥，母豬分娩正常，所產小豬吃奶前HI抗體陰性。另外，免疫的懷孕母豬用強毒株攻擊后49天剖殺，胎兒發育正常，胎心采血HI抗體陰性，取胎兒臟器進行組織培養也未分離出病毒，而對照豬攻毒后產生了病毒血癥并導致繁殖障礙，從胎兒臟器中分離出PPV。盡管已有多株弱毒疫苗在臨床上應用，但是由于PPV強毒株的大量存在，人們對病毒重組及弱毒返強的擔心一直使弱毒苗的應用受到一定限制。

2 滅活疫苗

（1）單價滅活疫苗 自1976年國外就有關于PPV滅活疫苗的研究報道，并于80年代在美國、澳大利亞、法國等國家普遍應用。在我國，潘雪珠等研制成功PPV滅活疫苗之后，韓孝成等、肖馳等、鄔捷等、呂建強等也先后研制出PPV滅活疫苗。PPV滅活疫苗的研制中，應用的滅活劑有福爾馬林、β-丙內酯（β-PL）、AEI（N-乙酰乙烯亞胺）以及BEI（二乙烯亞胺）等。Fujisaki用福爾馬林滅活病毒制成的疫苗，免疫動物誘導產生了較高的抗體滴度，但保護效果不理想；潘雪珠比較了福爾馬林和AEI的滅活效果，證實AEI優于福爾馬林；Joo等用β-丙內酯滅活的疫苗，可使豬產生的抗體至少持續4個月以上。免疫佐劑是影響PPV滅活疫苗效果的重要因素，Moliter等比較了13種不同佐劑用于PPV滅活疫苗的效果，結果發現50%氫氧化鋁膠，順丁烯乙酰(EMA)、CP-20961(Avridin)，油水乳劑及dimethyl–

dioctadecyl –ammonium bromide (DDA)作佐劑的疫苗，均誘導豬產生了高滴度的抗體，而用油佐劑、SDS、L-121、氫氧化鋁和油乳劑混合物、SDS和氫氧化鋁混合物作佐劑的疫苗產生的抗體滴度均較低。目前在PPV滅活苗的制備中，經常采用的佐劑是氫氧化鋁和油水乳劑。

（2）滅活二聯疫苗 PRV，PPV和JEV病均是引起母豬繁殖障礙的主要疾病，研制出滅活多聯疫苗可以簡化免疫程序，降低臨床應激反應，適合規模化養豬業的發展趨勢。Mengeling等將通過細胞培養增殖的PPV和PRV，用AEI在37℃滅活后混合，加入10%的Al(OH)3制成滅活二聯疫苗用于免疫預防試驗。16頭后備母豬進行兩次免疫，間隔期為2周，8頭母豬在妊娠后9周用PRV攻擊，8頭母豬在妊娠后6周用PPV攻擊，然后分別在第13周和12周宰殺，觀察保護情況。結果發現，16頭母豬均未發生繁殖障礙，從胎兒體內未檢出PRV和PPV。對免疫母豬的血清學檢測結果證實，經二次免疫后，母豬的PRV中和抗體和PPV HI抗體滴度，與采用單苗免疫的抗體水平相當或稍高，從而說明PRV—PPV滅活二聯疫苗具有良好的免疫保護作用。井出誠彌等曾用PPV和JEV二種病毒的弱毒疫苗混合后免疫母豬，產生的PPV和JEV抗體水平分別與相應單苗的相同。國內鄔捷等用PPV滅活苗與JEV滅活苗混合或同時免疫后備母豬均取得了滿意的效果。姜天童等利用幼齡胎豬生產PPV、利用小鼠增殖JEV后，分別滅活制成滅活二聯疫苗，通過二聯苗和單聯苗比較試驗顯示，二聯苗與兩種單苗免疫豬產生的PPV和JEV抗體水平無顯著差異。以上試驗均證實兩種病毒抗原同時刺激機體沒有相互干擾作用。

3 PPV疫苗的免疫程序 在早期的研究報告中，PPV疫苗的免疫均為間隔2-3周二次注射，隨著疫苗生產工藝的改進，許多學者發現一次免疫注射也能達到良好的效果，免疫后的后備母豬在妊娠40d時用強毒攻擊，可以獲得完全保護。此外，Edwards等認為PPV疫苗只能用于沒有母源抗體的豬，因為在田間條件下母源抗體可能在不同程度上干擾疫苗的效果。Paul等發現豬群在接種PPV滅活疫苗時，母源抗體水平低的豬與血清學陰性豬的免疫應答完全一樣，而中等水平的母源抗體對疫苗免疫有輕微干擾作用，高效價抗體對疫苗有明顯干擾作用。呂建強等進行了PPV母源抗體對滅活疫苗免疫效果影響的研究，結果證實不論母源抗體水平高低均不會明顯抑制疫苗的主動免疫反應，但是具有低效價母源抗體豬的主動免疫抗體反應規律，與具有高效價母源抗體豬的主動免疫抗體反應規律不同。在母源抗體滴度大于1:149.5時，滅活疫苗接種后抗體水平先降低然后上升，升幅只有1-3倍；而母源抗體小于1:25.6時，主動免疫抗體持續上升，母源抗體陰性的豬抗體增幅最大。根據PPV的流行病學特點，仔豬吃奶后2-3天即可在血液中檢測到母源抗體，并于8-14天達到高峰，母源抗體可持續20-24周，因此PPV疫苗的免疫接種時間應選擇在20周左右。建議，于配種前一個月、半個月各免疫一次。

4 新型疫苗展望 盡管PPV的弱毒苗和滅活苗在豬細小病毒病的預防控制中起到了十分重要的作用，但是各種疫苗均有不同程度的缺陷和不足，如弱毒疫苗發生重組及毒力返強的潛在威脅，以及滅活疫苗免疫效果不穩定等。因此，尋找和發展更為安全有效的疫苗一直是豬細小病毒病免疫預防研究的主題。

（1）基因工程亞單位疫苗 Martinez等將PPV VP2基因克隆到桿狀病毒表達系統中，并成功地在昆蟲細胞中高效表達，表達的VP2多肽能自我裝配成類病毒粒子(Virus-Like Particles，VLPs)，用其免疫母豬能誘導產生免疫應答。盡管未見有關該種疫苗進一步研究和應用的報導，但是VP2基因在體外表達的蛋白能自我包裝成類病毒粒子的特性，為重組多價亞單位疫苗的研究打下了基礎。

（2）基因工程多價亞單位疫苗 Sedlik等將PPV VP2和包含淋巴細胞脈絡叢腦炎病毒(LCMV)的118-132位氨基酸的抗原決定簇區相連，然后克隆于桿狀病毒表達載體PACYM，轉染表達PPV：VP2-LCMV蛋白，利用該重組蛋白免疫鼠可以誘導強烈的CTL反應，在體內持續時間長達9個月，并可抵抗致死量的LCMV攻擊。之后，Sedlik又將LCMV的CD8+ T細胞抗原決定簇多肽共價結合于1mm的脂質微球上，與上述表達的PPV：VP2-LCMV蛋白一起進行了免疫小鼠的比較，結果發現二者都能誘導產生很強的CD8+ T細胞反應。但是PPV：VP2-LCMV攜帶的抗原量比脂質體微球少100倍時，誘導的CTL活性仍比脂質體微球誘導的CTL活性高6倍，并且只有PPV：VP2-LCMV免疫的小鼠能抵抗致死量的LCMV的攻擊。Richard等用PPV VP2共價結合乙肝病毒HBSAg的抗原決定簇區多肽，然后免疫小鼠誘導產生了很強的針對插入的HBSAg決定簇的T細胞反應，并能抵抗乙肝病毒的致死性攻擊。這些結果均說明PPV VP2類病毒粒子，作為一種抗原的轉運載體具有很大的潛在價值，并為進行多價重組疫苗的研究創造了良好的條件。

PRV和PPV在臨床上經常混合感染的現象已有報導，因此研制出這二種病毒的重組疫苗對生產實踐也具有重要意義。PRV屬于皰疹病毒科a皰疹病毒亞科的豬皰疹病毒I型，該病毒基因組是雙鏈線狀的DNA，大小約為150Kbp，含有多個可缺失的非必需基因，插入外源基因容量可達20Kbp，易于進行基因操作，因此具有作為病毒載體的必要條件。迄今為止，國內外用PRV作基因表達載體已成功表達了10多種外源目的基因。如Zijl等最早實現了病原保護性抗原基因在偽狂犬病毒中的表達，他們將豬瘟病毒（HCV）的囊膜蛋白基因E1插入到gG啟動子的下游，構建了幾株表達E1的重組偽狂犬病毒；將這些重組病毒進行動物試驗，結果接種重組病毒的豬均能產生對HCV、PRV的高滴度中和抗體，并可保護豬免受PRV、HCV的強毒攻擊。國內,王家富等構建了攜帶豬瘟病毒E2基因的重組偽狂犬病毒。但是上述研究所用載體均為PRV弱毒株，人們對其安全性仍有擔心。為些，我們實驗室近年來成功地研制出PRV的TK-/gG-/LacZ+ 疫苗株，該毒株缺失了PRV的毒力基因（TK），并有LacZ+標志基因作為篩選標志，以供重組篩選，因而成為更為理想的重組病毒載體。鑒于PPV VP2基因的良好免疫原性，將其插入到PRV載體中，有望研制出理想的PPV—PRV二價重組基因工程疫苗。

（3）基因疫苗 基因免疫又稱核酸免疫，是由Wolff和Felgner于1990年偶然發現的，直接將編碼有目的蛋白基因和表達調控序列的DNA或RNA注射到動物機體內，利用機體的轉錄和翻譯系統，合成目的蛋白質，刺激機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫應答。這種能夠在體內表達外源蛋白，刺激機體產生免疫應答的核酸稱為核酸疫苗，包括DNA和RNA疫苗。由于基因疫苗具有易于構建和改造，規模化生產成本低廉，具有良好的熱穩定性、可誘導機體產生全面的免疫應答，故被認為是繼減毒、滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗，并被稱作是“疫苗的第三次革命”。在1994年的世界衛生組織會議上，與會專家一致認為核酸疫苗將成為疾病防治中的又一個重要手段，特別是它將在一種疫苗預防多種疾病方面發揮作用。盡管對核酸疫苗進行了理論和應用方面的詳細探討，但是其作用機理目前尚未闡明。理論上認為，迄今所有用于主動免疫的第一、二代疫苗都可完善成效果更加理想的核酸疫苗。趙俊龍等進行了有關PPV核酸疫苗的研究，動物試驗初步表明，以PPV結構基因VP1和VP2分別構建的核酸疫苗，均能誘導產生較高水平的體液免疫和細胞免疫，比常規滅活疫苗產生的高。核酸疫苗的生產簡便、成本低廉，也預示著其具有理想的應用前景。（未發表）

（4）轉基因植物可飼(食)疫苗 轉基因植物可飼(食)疫苗是在二十世紀八十年代，利用植物基因工程技術創造轉基因植物的基礎上發展起來的。首先進行轉基因植物可飼疫苗研究的是Curtiss和Cardineau，他們以專利的形式發表了他們的第一篇報告。Mason等報道了在轉基因植物中表達乙肝表面抗原，提出轉基因植物疫苗的概念，他們在研究HBSAg在轉基因植物中表達時，發現外源基因在轉基因植物中的轉錄和翻譯沒有受到限制，不僅可以正常編碼蛋白，而且可以組裝形成類病毒顆粒。正是基于這一點，我們認為有望開發出PPV轉基因植物可飼疫苗，因為PPV的VP2基因表達后能自我形成類病毒粒子，這對保持其免疫原性是非常重要的；另外，VP2基因表達的類病毒粒子可以作為其它抗原的轉運載體，這為開發多價的轉基因植物疫苗提供了條件。