中藥添加劑對高溫中豬血清抗氧化功能的影響

貔貅 · 發(fā)表于 2007-11-2 15:04:12

宋小珍　毛帥　劉鳳華　王恬
（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)院南京210095　2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院南昌330045

3.北京農(nóng)學(xué)院動物科技系北京102206）

　　隨著全球氣候的逐步變暖，夏季高溫高濕氣候給規(guī)模化養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來的負(fù)面影響相當(dāng)嚴(yán)重。熱應(yīng)激是畜禽在外界高溫環(huán)境刺激下所出現(xiàn)的全身性非特異反應(yīng)。在熱應(yīng)激狀態(tài)下，豬體內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，細(xì)胞膜流動性下降，膜功能受損，對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降(Gerald Karp,2005)。目前國內(nèi)外關(guān)于應(yīng)激的調(diào)控，大都使用化學(xué)添加劑如電解質(zhì)、鎮(zhèn)靜劑、抗生素、維生素、微量元素等，多數(shù)是治標(biāo)不治本，且容易出現(xiàn)毒副作用和藥殘（李英哲等，2001；徐荷等，1997）。中藥添加劑是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)， “以調(diào)為本，以平為期”，在組方時注重從平衡陰陽、全面調(diào)節(jié)畜禽機(jī)體免疫力入手；且其具有獨(dú)特的天然性，毒副作用小，在調(diào)控畜禽熱應(yīng)激綜合癥上應(yīng)用前景廣闊。但目前有關(guān)中藥添加劑抗應(yīng)激的研究大多集中在對畜禽生產(chǎn)性能的影響上，有關(guān)中藥添加劑對熱應(yīng)激中機(jī)體抗氧化能力的調(diào)控作用鮮見報道。
　　超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)是機(jī)體的兩大抗氧化酶系統(tǒng)，對清除體內(nèi)過量的自由基，維持氧自由基代謝的平衡起著重要的作用；丙二醛（malondialdehyde,MDA）是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈?zhǔn)浇K止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物，其含量可以間接反映自由基的產(chǎn)生情況和機(jī)體組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度（李繼紅等，2003）。本試驗(yàn)試圖通過觀察高溫下添加抗應(yīng)激中藥飼料添加劑，對高溫環(huán)境下豬血液中SOD、GSH-Px、MDA等一些與自由基有關(guān)的生化指標(biāo)的動態(tài)影響，研究并探討中藥添加劑對豬的抗應(yīng)激效果及機(jī)理。
1．材料與方法1.1試驗(yàn)材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所動物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工氣候室。
1.1.2實(shí)驗(yàn)動物：64只35日齡、體重6.50±1.05Kg的中國試驗(yàn)用小型豬（CEMP，農(nóng)大I系）, 常規(guī)免疫。購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昌平試驗(yàn)豬場。
1.1.3中藥添加劑：方1：由石膏、藿香、蒼術(shù)、黃柏按等比例組成。方2：由石膏、藿香、蒼術(shù)、黃柏按0.5：1：1：1比例組成。
1.1.4試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1　基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

原料（Ingredients）　組成/%（Comp osition）	營養(yǎng)成分（Nutrient levels）　　　　含量(Content)
玉米（Corn ）　　　　　52.0	消化能DE/(MJ·kg-1)　　　　　　　　13.89
豆粕（Soybean meal）　13.0	粗蛋白CP/%　　　　　　　　　　　　　20.00
魚粉（Fish meal）　　　6.0	鈣Calcium/%　　　　　　　　　　　　0.95
乳清粉（Whey）　　　　6.0	總磷(Total Phosphorus)/%　　　　　　0.70
膨化大豆（Expanded soybean）16.0	有效磷(Available Phosphorus)/%　　　0.49
小麥麩（Wheat bran）　　　3.0	賴氨酸(L-L ys)/%　　　　　　　　　　1.35
預(yù)混料（Premix）　　　　4.0	蛋+胱氨酸(Met + Cys)/%　　　　　　　0.66

　　注：4% 預(yù)混料為每千克全價料提供Cu 200mg、Fe 120mg、Zn 120mg、Mn 50mg、Co 2.0mg、Se 0.3mg、I 0.45mg、維生素A 800IU、維生素D31 800IU、維生素E 30IU、維生素B11.8mg、維生素B2 6mg、維生素B12 0.024mg、葉酸0.3mg、生物素0.44mg、煙酸3.2mg、膽堿800mg。
1.1.5主要試劑、實(shí)驗(yàn)儀器：SOD、GSH-Px、MDA測試試劑盒，南京建成有限公司。紫外－可見分光光度計UV-2000。
1.2 試驗(yàn)動物分組
本試驗(yàn)采用農(nóng)大小型實(shí)驗(yàn)豬64頭，按窩別、體重相近原則分成4組，分別為常溫對照組（簡稱對照組）、高溫應(yīng)激組（簡稱應(yīng)激組）、中藥添加劑1組（簡稱方1組）和中藥添加劑2組（簡稱方2組）。每組4個重復(fù)，每重復(fù)4頭豬。
1.3 飼養(yǎng)管理
預(yù)飼期，各處理組豬的飼養(yǎng)水平、環(huán)境完全相同，試豬自由采食和飲水。正式試驗(yàn)期間，各組實(shí)驗(yàn)豬均飼養(yǎng)于人工氣候室中（對照組的飼養(yǎng)環(huán)境溫度設(shè)為23℃恒溫，應(yīng)激組和兩個中藥方劑組的飼養(yǎng)環(huán)境溫度根據(jù)前期試驗(yàn)得出的熱應(yīng)激模型設(shè)溫為26℃~40℃循環(huán)變溫，見圖1），各處理組的環(huán)境濕度、設(shè)置完全一致（詳見表2試驗(yàn)設(shè)計）。各處理基礎(chǔ)日糧完全相同，自由飲水。其中，中藥添加劑1組和2組在基礎(chǔ)日糧上按0.5%添加中藥添加劑方1和方2。

表2　試驗(yàn)設(shè)計

處理(treat)	日糧(diet)	環(huán)境溫度（environmental temperature）
對照組(NTC)	基礎(chǔ)日糧(basal diet)	溫度(T)：23℃；濕度(H)：60%；光照度(L)：100LX
應(yīng)激組(HTS)	基礎(chǔ)日糧(basal diet)	溫度(T)：26~40℃；濕度(H)：60%；光照度(L)：100LX
方1組 (CMAΙ)	基礎(chǔ)日糧(basal diet)+0.5％中藥添加劑1(Chinese medicine additives Ι)	溫度(T)：26~40℃；濕度(H)：60%；光照度(L)：100LX
方2組 (CMAⅡ)	基礎(chǔ)日糧(basal diet)+0.5％中藥添加劑2(Chinese medicine additivesⅡ)	溫度(T)：26~40℃；濕度(H)：60%；光照度(L)：100LX

人工氣候艙溫度曲線如圖1：

圖1　人工氣候室溫度曲線
（X軸為時間0：00－22：00，Y軸為溫度0－45℃）

1.4 樣品采集與制備
在熱應(yīng)激正式試驗(yàn)第1、2、4、6、10天從每重復(fù)中選1只小豬（每組4只），頸靜脈采血10ml，靜置（離心）析出血清，于-20℃箱中保存?zhèn)溆谩?br /> 1.5測試指標(biāo)與方法
SOD : 羥胺法；GSH-PX：DTNB 直接法； MDA: TBA(硫代巴比妥酸)法。采用分光光度計檢測。
1.6 統(tǒng)計分析
采用SAS軟件分析平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差，多重比較方差分析。

2 結(jié)果與分析 2.1中藥添加劑對熱應(yīng)激豬血清SOD活性的影響
表3中藥添加劑對熱應(yīng)激豬血清SOD活性的影響　　　單位：活力單位/毫升（U/ ml）

天數(shù)（d）處理(treat)	1	2	4	6	10
對照組(NTC)	50.91±0.98b	51.51±8.19	52.88±5.51	50.48±5.18	50.06±5.19
應(yīng)激組(HST)	65.06±4.57a	44.14±3.13	48.98±4.58	53.06±2.61	53.83±8.07
方1組(CMAΙ)	56.35±13.48ab	44.82±5.04	49.46±3.62	44.78±5.08	54.79±6.95
方2組(CMAⅡ)	62.76±2.96a	51.17±5.88	51.69±4.41	50.31±4.41	51.74±4.67

注：同一列中相同字母表示差異不顯著（p>0.05）；不同字母表示差異顯著（p<0.05）。以下表均同。
由表3可知，各組試豬血清中SOD活性變化主要表現(xiàn)在應(yīng)激后第1天。與對照組相比，應(yīng)激組在第1天顯著升高，而后逐漸下降，到第10天又有所回升，但不出現(xiàn)顯著差異（p>0.05）。方1組的SOD活性與對照組和應(yīng)激組間均無顯著差異（p>0.05）。方2組的SOD活性顯著高于對照組（p<0.05），與應(yīng)激組之間無顯著差異（p>0.05）。
2.2中藥添加劑對熱應(yīng)激豬血清MDA含量的影響
表4? 中藥添加劑對熱應(yīng)激豬血清MDA含量的影響
單位： n mol/ ml

天數(shù)（d）處理(treat)	1	2	4	6	10
對照組(NTC)	3.18±0.95	2.99±0.83	2.59±1.01	3.62±0.07b	3.58±0.33b
應(yīng)激組(HST)	3.15±1.41	3.55±1.02	3.42±0.25	4.85±1.29a	5.19±1.15a
方1組(CMAΙ)	3.33±0.97	2.19±1.18	3.09±0.87	4.92±0.37a	4.28±0.41b
方2組(CMAⅡ)	2.93±0.66	3.46±0.48	3.15±0.95	4.13±0.10ab	4.10±1.16b

表4的結(jié)果得出，各組豬血清中MDA含量的差異主要表現(xiàn)為試驗(yàn)后第6、10天。與對照組相比，應(yīng)激組血清中 MDA值在第6、10天時表現(xiàn)出顯著升高（p<0.05）。方1組在第6天顯著高于對照組，第10天顯著低于應(yīng)激組（p<0.05）。方2組在第6天MDA含量介于對照組和應(yīng)激組之間，與兩者差異均不顯著（p>0.05）；第10天顯著低于應(yīng)激組（p<0.05），其余時間不呈現(xiàn)顯著差異（p>0.05）。
2.3中藥添加劑對熱應(yīng)激豬血清GSH-PX活性的影響
表5? 中藥添加劑對熱應(yīng)激豬血清GSH-PX活性的影響
單位：酶活力單位/毫升（U/ ml）

天數(shù)（d）處理(treat)	1	2	4	6	10
對照組(NTC)	1259±46	1271±156b	1283±411	1195±238b	1151±314b
應(yīng)激組(HST)	1262±129	1239±96b	1221±100	1681±183a	1559±268a
方1組(CMAΙ)	1282±154	1616±187ab	1406±190	1565±28a	1572±255a
方2組(CMAⅡ)	1225±232	1799±381a	1306±221	1480±177ab	1402±82ab

　　表5的結(jié)果表明，應(yīng)激組血清中GSH-PX活性在第6和10天顯著高于對照組（p<0.05）；方1組在第6、10天顯著高于對照組（p<0.05）。方2組在第2天GSH-PX活性顯著高于應(yīng)激組（p<0.05），在第6、10天介于對照組和應(yīng)激組之間，與兩者差異均不顯著（p>0.05）。
3. 討論3.1 高溫應(yīng)激對豬血清中SOD、GSH-PX活力及MDA含量的影響
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高溫應(yīng)激后豬血清中MDA含量顯著高于常溫組，這表明高溫應(yīng)激加速了機(jī)體組織的脂質(zhì)過氧化過程，產(chǎn)生了較多的有害物質(zhì)丙二醛（MDA）。同時，研究也發(fā)現(xiàn)試豬血清中SOD、GSH-PX活力在應(yīng)激后出現(xiàn)明顯增高，這可能是機(jī)體氧自由基大量產(chǎn)生刺激了體內(nèi)的自由基清除系統(tǒng)，一定程度上激活了機(jī)體的抗氧化酶系統(tǒng)功能。徐荷等（1997）研究熱應(yīng)激對ＳＤ大鼠 SOD 活性的影響發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激后SOD活性升高，持續(xù)熱應(yīng)激后SOD活性下降。Balázs Borsiczky（2003）報道，受熱初期，隨著機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，脂質(zhì)過氧化活動的增強(qiáng)，自由基誘發(fā)了抗氧化酶的表達(dá)，SOD活性也隨之升高，這是機(jī)體的一種代償保護(hù)作用，但持續(xù)受熱后，SOD活性則受到抑制。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激后期血清中SOD活性出現(xiàn)下降趨勢，但差異不顯著。許燕等（2000）也報道，應(yīng)激過程中，機(jī)體產(chǎn)生的自由基大量增加，同時機(jī)體自由基清除系統(tǒng)的活性也增高，隨著應(yīng)激時間的延長，盡管清除系統(tǒng)活性增加，但仍不足以及時將大量的自由基清除織造成了機(jī)體氧化和抗氧化的失平衡，從而使細(xì)胞破壞，造成組織損傷。但本研究對血清中SOD和GSH-PX兩種抗氧化酶活性動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，兩種酶的變化規(guī)律并不一致，SOD活性在前期顯著上升，后期下降；但GSH-PX活性卻在應(yīng)激后期出現(xiàn)明顯增高，其原因是否與兩者的作用機(jī)制有關(guān)，尚需要進(jìn)一步研究。
3.2 中藥添加劑對應(yīng)激狀態(tài)下豬血液抗氧化功能的影響
　　本研究結(jié)果顯示，與應(yīng)激組相比，添加中藥添加劑2后，豬血液中MDA含量出現(xiàn)顯著下降；同時，SOD、GSH-Px活性在應(yīng)激后期有下降趨勢，其活力值介于常溫組和高溫組之間。這說明中藥添加劑2能增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，調(diào)控機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)功能，使其保持正常水平。方1組對以上指標(biāo)也有一定調(diào)控作用，但效果低于方2。這表明在調(diào)控?zé)釕?yīng)激狀態(tài)下豬血清抗氧化功能上，中藥添加劑2的效果優(yōu)于中藥添加劑1。
　　本試驗(yàn)中兩個中藥添加劑組成均為石膏、蒼術(shù)、黃柏和藿香等，其主要功效為清熱瀉火、燥濕健脾，解表和中，主要用于緩解動物在夏季高溫高濕環(huán)境中出現(xiàn)的熱應(yīng)激病癥。中藥藥理研究證明，石膏屬清熱瀉火藥，善清氣分實(shí)熱，常用于肺胃大熱，高熱不退等實(shí)熱亢盛證。研究表明，生石膏可抑制發(fā)熱中樞而起解熱作用。藿香重在化濕，和中止痛，解暑。蒼術(shù)屬燥濕藥（樸世浩，1996）；黃柏具有清濕熱，瀉火毒，退虛熱的作用，以除下焦?jié)駸嶙罴眩ㄍ鹾馄妫?001）。黃柏對應(yīng)激性胃潰瘍有抑制作用且對水浸捆束小鼠SOD活性的降低有明顯的抑制作用（呂燕寧，2006）。四藥合用可通過促進(jìn)腸道分泌，抑制有害腸道菌群，清除腸道有害自由基等途徑加強(qiáng)對高溫環(huán)境下機(jī)體膜結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)。但方1中石膏比例較方2高。石膏的變化主要在于劑量變化導(dǎo)致君藥不同。方1以石膏為君藥，主要針對北方高溫干燥氣候，變化急驟，發(fā)自陽明，重在清氣；方2針對南方濕熱氣候，藿香、蒼術(shù)為主，重在健脾化濕、祛濕。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)方2效果優(yōu)于方1，分析可能人工氣候室各參數(shù)設(shè)置與南方夏季高溫高濕的氣候接近有關(guān)。