高溫下清涼沖劑對雞免疫器官中CD4+、CD8+T細胞數量影響的動態觀察

貔貅

摘要目的：旨在通過研究清涼沖劑對雞免疫器官中CD4+、CD8+T細胞含量的動態變化影響，探討其在高溫狀態下對機體細胞免疫機能的作用效果，為研究清涼沖劑的藥理作用提供理論依據。方法：108只農大3號35日齡公雛，隨機分為3組，每組36只雞，分別為常溫對照組、高溫對照組和高溫用藥組，用藥組飼喂中藥煎劑（濃度為1g/ml），喂藥量與飼料量比為1：1000。在實驗的第1、4、8、10天各組剖殺5只，分別采取胸腺、脾臟、法氏囊，利用免疫組化方法測定各免疫器官中CD4+、CD8+T細胞含量。結果：在高溫過程中，用藥組免疫器官中CD4+、CD8+T細胞水平均高于高溫對照組，且以第8天最明顯，差異顯著或極顯著。結論：清涼沖劑可以提高高溫下雞免疫器官中CD4+、CD8+T細胞的含量，表明清涼沖劑在高溫環境下可以有效增強雞的細胞免疫水平。
關鍵詞清涼沖劑 CD4+ CD8+T 細胞免疫免疫組化

Dynamic Effect of Qingliang Decoction to CD4+ and CD8+T cell Average Positive Rate in the Immune Organs of Chicken Under Heat-Stress

Li xinguo1,2Xu jianqin3Hu yanxin3 Xu guangke1,2 Liu fenghua2

（1,Xinjiang Agricultural University, Xinjiang 830052; 2Beijing Agricultural College, Beijing 102206;

3,China Agricultural University, Beijing 100094）

AbstractThe aim of this experiment was to study the effects of Qingliang decoction through detecting the average positive rate of CD4+、CD8+T in the immune organs of chicken under high temperature. One hundred and eight Nongda 1 male chicken were randomly divided into 3 groups. It included of two controls without the decoction under normal and high temperature; and another treatment toke orally Qingliang decoction (0.1% of ration) in water under high temperature. Then the thymu, spleen, and bursal from each group were collected to detect the average positive rate of CD4+、CD8+ T－cell by immunohistochemistry and Motic image analyzing system. The results showed that the treatment with Qingliang decoction under high temperature increased gradually during the experiment period. It indicates that the Qingliang decoction may increase the average positive rate of CD4+、CD8+T-cell in immune organs under the heat-stress, improve the immune function.
Key WordQingliang decoction, CD4+,CD8+, Cell immune, Immunohistochemisty
    高溫影響肉雞的生長發育及生產性能，同時對機體的免疫機能產生很大影響，是誘發疫病流行的重要應激因素之一[1]。大量實驗證明，熱應激是通過作用于下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸促使糖皮質激素分泌，從而抑制機體的體液免疫和細胞免疫[2] [3]。機體的細胞免疫主要由T淋巴細胞介導來完成，根據其表面標志可將其分為兩大類，即CD4+、CD8+T淋巴細胞，是T淋巴細胞的表面標志[4]。本實驗擬通過對免疫器官中成熟T細胞，即CD4+T細胞和CD8+T細胞的數量動態變化為指標，探討在高溫環境下清涼沖劑對雞細胞免疫功能的影響，為清涼沖劑的開發奠定理論基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
試驗動物：農大3號35日齡公雛108只，購自北京昌平區試驗雞場。
中藥清涼沖劑：由石膏(Gypsum Fibrosum)、藿香(Herba Agastachis)、蒼術(RhizomaAtractylodis)、黃柏(Cortex Phellodendri)按等比例組成。
儀器及試劑：鼠抗雞CD4+、CD8+單抗，Southern Biotechnology,Inc產品；HistostainTM-Plus Kits:ZYMED公司SP-9002免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；DABKit:顯色劑，美國ZYMED公司產品（北京中杉金橋生物技術有限公司）；BH2 Olympus生物顯微鏡；AO820型切片機（Amersham optical）；Motic病理圖像分析系統3.0
1.2試驗方法

1.2.1分組試驗從35日齡起至45日齡，試驗期10天。隨機平均分為3組，分別為常溫對照組、高溫對照組、高溫用藥組，每組36只雞。

表1：試驗分組

table1:the grouping ofexperimentation

常溫對照組（22℃） normal temperature control	高溫對照組（26～39℃） high temperature control（26～39℃）
常溫對照組 normal temperature control	高溫對照組 high temperature control	高溫用藥組 group 1

1.2.2人工氣候艙溫度曲線設計：（見圖1）

1.2.3飼養管理實驗動物飼喂北京震亞飼料廠生產的蛋雞全價料，高溫用藥組飼喂中藥清涼沖劑，喂藥量與飼料量比為1：1000；對照組自由采食，進入人工氣候倉適應3天后開始熱應激，共10天。24小時循環變溫。變溫曲線見圖1。常溫組始終保持22℃。

1.2.4采樣及切片制備各組分別于熱應激第1、4、8、10天高溫結束后隨機選取5只雞剖殺，分別采取脾臟、胸腺、法氏囊，用生理鹽水沖洗干凈并及時置于4%甲醛溶液中固定，常規石蠟切片，免疫組化染色，使用Motic病理圖像分析系統照相并進行平均陽性率的灰度分析。

平均陽性率灰度分析方法如下：

1.3 試驗數據處理方法數據使用DPS3.01數據處理系統進行平均數、方差分析。

2 結果

2.1高溫下清涼沖劑對脾臟中CD4+、CD8+T細胞數量影響的動態觀察（表2）

表2高溫下清涼沖劑對雞脾臟中CD4+、CD8+T細胞數量的影響(,n=5)

Table2. Effect of Qingliang decoction tothe average positive rate of CD4+、CD8+Tin
the spleen ofchicken under heat-stress單位（unit）：%

脾臟		第1天（1stday）	第4天（4thday）	第8天（8thday）	第10天（10thdya）
常溫對照組 normal control	CD4+T	45.476±0.514	46.105±0.358	45.273±0.462	45.539±0.524
	CD8+T	35.476±1.492	35.803±0.487	34.749±0.348	35.037±0.378
高溫對照組 high control	CD4+T	27.829±0.687＃＃	32.787±0.629＃＃	33.724±0.842＃＃	34.69±0.529＃＃
	CD8+T	24.235±0.761＃＃	28.352±1.237＃＃	28.365±0.328＃＃	30.639±0.125＃＃
高溫用藥組 drug group	CD4+T	28.451±0.542	33.161±0.237	44.256±0.628**	43.635±0.347**
	CD8+T	25.198±0.328	29.152±1.028	34.265±0.349**	35.195±0.529**

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01，與常溫對照組比較；* P<0.05, ** P<0.01,與高溫對照組比較）

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01,compared with the normal control; * P<0.05, ** P<0.01,compared with the high control）

    從表2中可以看出，常溫對照組中CD4+、CD8+T細胞量保持一較穩定狀態；高溫對照組中雖然呈現一上升的趨勢，但其含量遠低于常溫對照組，且各天差異都極顯著（P<0.01）；高溫用藥組也呈現一上升的趨勢，各天均高于高溫對照組，與高溫對照組相比較，第8、10天差異極顯著（P<0.01）。

2.2高溫下清涼沖劑對胸腺中CD4+、CD8+T細胞數量影響的動態觀察（表3）

表3高溫下清涼沖劑對雞胸腺中CD4+、CD8+T細胞數量的影響(,n=5)

Table3. Effect of Qingliang decoction tothe average positive rate of CD4+、CD8+Tin the thymus of

chicken under heat-stress單位（unit）：%

胸腺		第1天（1stday）	第4天（4thday）	第8天（8thday）	第10天（10thdya）
常溫對照組 normal control	CD4+T	43.473±0.286	42.827±0.624	43.193±0.318	43.718±0.831
	CD8+T	30.589±0.134	31.257±0.825	31.029±1.05	31.729±1.27
高溫對照組 high control	CD4+T	29.784±1.52＃＃	34.627±0.516＃＃	34.682±0.642＃＃	36.572±0.487＃＃
	CD8+T	20.563±1.06＃＃	22.365±0.457＃＃	25.369±0.189＃＃	26.321±0.382＃＃
高溫用藥組 drug group	CD4+T	30.211±0.854	35.478±1.31	41.256±0.628**	42.635±0.649**
	CD8+T	21.152±0.482	23.258±0.458	30.236±0.492**	30.365±0.584**

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01，與常溫對照組比較；* P<0.05, ** P<0.01,與高溫對照組比較）

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01,compared with the normal control; * P<0.05, ** P<0.01,compared with the high control）

    從表3中可以看出，常溫對照組中CD4+、CD8+T細胞含量保持一較穩定狀態；高溫對照組中雖然呈現一上升的趨勢，但其含量遠低于常溫對照組，且各天差異都極顯著（P<0.01）；高溫用藥組也呈現一上升的趨勢，各天均高于高溫對照組，于第8天達到最大差異值6.574、4.867，與高溫對照組相比較，第8、10天差異極顯著（P<0.01）。

2.3高溫下清涼沖劑對法氏囊中CD4+、CD8+T細胞數量影響的動態觀察（表4）

表4高溫下清涼沖劑對雞法氏囊中CD4+、CD8+T細胞數量的影響(,n=5)

Table4. Effect of Qingliang decoction tothe average positive rate of CD4+、CD8+Tin the bursa of

chicken under heat-stress單位（unit）：%

法氏囊		第1天（1stday）	第4天（4thday）	第8天（8thday）	第10天（10thdya）
常溫對照組 normal control	CD4+T	28.4±0.567	28.647±0.927	28.516±0.634	28.459±0.260
	CD8+T	34.052±0.478	34.374±0.305	33.746±0.286	34.827±0.542
高溫對照組 high control	CD4+T	14.876±0.371＃＃	23.765±0.674＃＃	25.298±0.548＃＃	23.685±0.628＃＃
	CD8+T	24.852±0.492＃＃	28.689±0.255＃＃	29.302±0.347＃＃	29.624±0.127＃＃
高溫用藥組 drug group	CD4+T	15.361±0.167	24.345±0.329	28.055±0.274**	25.797±0.561**
	CD8+T	25.161±0.682	38.945±0.286	34.105±0.821**	33.797±0.319**

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01，與常溫對照組比較；* P<0.05, ** P<0.01,與高溫對照組比較）

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01,compared with the normal control; * P<0.05, ** P<0.01,compared with the high control）

    從表4中可以看出，常溫對照組中CD4+、CD8+T細胞含量保持一較穩定狀態；高溫對照組中雖然呈現一上升的趨勢，但其含量遠低于常溫對照組，且各天差異都極顯著（P<0.01）；高溫用藥組也呈現一上升的趨勢，各天均高于高溫對照組，于第8天達到最大差異值2.757、4.853，與高溫對照組相比較，第8、10天差異極顯著（P<0.01）。
3 討論與結論
    CD4+、CD8+是相互關聯、但意義不同的2個分子，是T細胞亞群的表面標志。表達CD4+的主要是輔助性T細胞，表達CD8+的主要是細胞毒性T細胞。CD4+和CD8+分子可增強CD3-TCR對MHC抗原的親和力，并有助于激活信號的傳遞。CD4+分子增強對MHCⅡ類抗原的結合，CD8+分子則增強對MHCⅠ類抗原的結合[5]。CD4+T淋巴細胞作為調節細胞，主要是啟動免疫應答和控制初次感染；而CD8+T淋巴細胞作為一種效應細胞，則是抵抗再感染的主力。二者分工不同，但又密不可分。通過釋放各種細胞因子，相互促進，相互協調，共同完成抗感染作用。Gazziindlli(1999)也證實了CD4+和CD8+T淋巴細胞在抵抗感染中的協同作用[6]。Lisa,Trout等人試驗也說明，CD4+、CD8+T淋巴細胞在細胞免疫中起主要作用[7，8]。故可通過對CD4+、CD8+T淋巴細胞數量多少的測定來判定機體的細胞免疫水平。
    胸腺是機體重要的中樞免疫器官之一， T淋巴細胞在胸腺中成熟，獲得其功能及學習識別自我，完成T淋巴細胞的陽性選擇(識別抗原/MHC的克隆增殖,成熟并移行至周圍)和陰性選擇(排除能將自身抗原作為異物起反應的克隆)的雙重功能。并決定外周免疫器官的發育。脾臟是最大的外周免疫器官，也是發生免疫反應的主要場所。法氏囊是禽類特有的中樞免疫器官，是B細胞繁殖分化的主要場所，但同時它還作為外周淋巴器官，捕捉抗原和合成某些抗體，存在少量的T淋巴細胞[9]。
    從試驗結果數據看，高溫環境明顯對雞各免疫器官中CD4+、CD8+T淋巴細胞具有抑制作用，高溫對照組明顯低于常溫對照組，各天差異性都極顯著。清涼沖劑中君藥石膏在20世紀80年代前主要通過退熱作用，探討其作用機制。在近年的研究中發現，石膏亦能夠非特異性增強動物細胞及體液免疫水平[10，11，12]。本實驗中高溫用藥組各免疫器官中CD4+、CD8+T淋巴細胞數量高于高溫對照組而低于常溫對照組，至高溫第8、10天時基本接近常溫對照組，其中以第8天差異性最顯著，也說明了以石膏為主的中藥復方對提高機體免疫器官中CD4+、CD8+T淋巴細胞具有很好的促進作用，能促使機體在極端高溫應激中迅速恢復穩態。
    綜上所述，高溫環境對雞免疫器官中CD4+、CD8+T淋巴細胞數量具有抑制作用，從而降低機體細胞免疫水平。復方清涼沖劑在高溫環境下對雞免疫器官中的CD4+、CD8+T細胞數量具有促進作用，表明了清涼沖劑可以在高溫環境下增強機體細胞免疫功能。