北京鴨膽囊收縮素cDNA克隆與序列分析

貔貅

董虹1，張永東1，劉鳳華2，許劍琴1 （1中國農業大學動物醫學院北京海淀100094，2 北京農學院動科系北京昌平 102206）

摘要：根據GenBank上登陸（登陸號為GGA251273）的雞膽囊收縮素（CCK）基因，設計了一對特異性引物，從鴨腺胃、十二指腸和空腸提取總RNA，通過反轉錄－聚合酶鏈反應（RT-PCR）擴增，將從十二指腸和空腸中擴增出的產物克隆到pGEM-Teasy載體上，并導入大腸桿菌JM109，陽性克隆經雙酶切鑒定后，進行測序和序列分析。結果腺胃未能擴增到目的片斷，其它兩組織都擴增到長度為220bp，編碼膽囊收縮素的cDNA。與雞的膽囊收縮素核苷酸序列相比較，同源性為88.6%。 關鍵詞：鴨膽囊收縮素；克隆；序列分析     膽囊收縮素（CholecystokininCCK）是由胃腸黏膜Ｉ細胞分泌，33個氨基酸組成的多肽類激素，具有收縮膽囊和刺激胰酶分泌，促進胃酸、胰液的分泌，增強胰酶活性，刺激胃腸平滑肌收縮，促進遠端十二指腸和空腸的蠕動及降低食物消化、延緩胃排空等功能[1]。中醫上脾乃“后天之本”，具有運化水谷精微，運化水濕的功能。脾失健運，則消化吸收功能失職，出現一系列與消化障礙有關的疾病。研究顯示[2]脾虛不同階段膽囊收縮素分泌不同，提示CCK可做為脾虛證的一個客觀性和特異性指標。本試驗運用RT-PCR技術成功地克隆了北京鴨CCK基因片斷，不僅為進一步研究鴨CCK基因的全序列及其在鴨體內的分布奠定基礎；同時也為從分子水平探討脾虛與CCK之間關系，進一步探究健脾消食中藥促進動物生長的機理奠定基礎。 1.材料與方法 1.1試驗動物     健康30日齡北京鴨，頸動脈放血后采腺胃、空腸和十二指腸，液氮速凍，-80℃保存備用。 1.2工具酶和試劑     JM109、pGEM-T Easy Vector 試劑盒、EcoRⅠ等限制性內切酶及M-MLV 反轉錄酶、T4-DNA連接酶、X-gal、IPTG為Promega公司產品，DNA Marker、Taq DNA聚合酶、瓊脂糖為上海生工生物工程公司技術服務有限公司產品。質粒純化試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產品。總RNA小量提取試劑盒和膠回收試劑盒為博大泰克產品。 1.3引物的設計 參照GenBank中已登陸的雞CCK基因序列，設計了一對引物。 上游引物：5’ATT ATT GAT AGC TCC CAG GAC AGT-3’ 下游引物：5’-GAG GTG GCT CAG CAG TTC ATC-3’ 引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。 1.4鴨腺胃、空腸、十二指腸CCK總RNA提取及cDNA第一條鏈的合成     30日齡北京鴨頸動脈放血，取腺胃、空腸和十二指腸，液氮速凍，采用博大泰克公司總RNA提取試劑盒，分別取組織50mg，加入玻璃研磨器中，吸入預冷的變性劑，冰浴研磨至無明顯組織塊，醋酸鈉溶解分離，酚－氯仿－異戊醇抽提，異丙醇沉淀，適量雙蒸水溶解總RNA，用微量核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度，取2μgRNA，10mM dNTP，25單位Rnasin 抑制劑，200單位MMLV逆轉錄酶，25μL反應體系中合成第一條鏈。 1.5北京鴨CCK cDNA部分片段的擴增     50μL反應體系中加入1.0μLcDNA為模板，25Mm MgCl2 4.0μL，5U Taq-DNA 0.125μL、10×buffer 5.0μL、10mM dNTPs4.0μL、12.8pmol上下游引物各2.5μL，反應液在95℃預變性5min，94℃變性50s、52.8℃退火40s、72℃延伸40s、共31個循環，最后72℃保溫8min。PCR結束后取取20μL進行電泳鑒定。 1.6基因克隆     擴增產物1％瓊脂糖凝膠電泳，通過與DNA分子量標準對照檢測后，將含有目的片段的瓊脂塊切下，采用玻璃奶法回收法，將回收產物連接到pGEM-T載體，轉化到JM109感受態細胞中，并涂布于含IPTG、X-Gal和氨芐青霉素（AMP）的LB培養基，37℃過夜培養，進行籃白斑篩選。挑取生長良好的白色菌落接種于含AMP的SOC液體培養基擴增培養。按照堿裂法提取質粒，進行酶切鑒定。 1.7重組質粒的酶切鑒定     將篩選的陽性重組質粒用EcoRⅠ進行雙酶切鑒定，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外觀察，酶切鑒定正確的質粒，原菌液過夜搖菌飽和后，送上海生工生物技術服務有限公司進行序列測定，并將測得的CCK基因序列與雞的進行比較分析。 2.結果 2.1 RT-PCR     用微量核酸蛋白檢測儀測定提取的CCK 總RNA含量，其A260/280比值均在1.7-2.0之間，證明提取的RNA較純。RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鴨空腸和十二指腸均擴增出長度為220bp左右，與設計結果大小完全相符的目的片斷（見圖1）；鴨腺胃中未擴出目的片斷。 2.2重組質粒的鑒定     將純化的PT-PCR產物連接pGEM-T載體中，轉化E.coli感受肽細胞JM109中，培養后提取質粒用EcoRⅠ對質粒酶切鑒定，結果得到了與預期大小一致的約220bp的片斷，見圖2。 2.3測序結果及對比分析 測序發現，插入pGEM-T載體的PCR產物全長693bp。其中CCK基因長度為220bp，和雞核苷酸序列相比較，同源性為88.6%，測序結果見圖3。 Duck-cckTACTCCTCCTAAAGAACAGCAGACTATAGCAACAAGAAAA40 Chick-cck----------------------g-g---------g----g40 Duck-cckAAAAAATCACACTCCTATGCCTGTACAGAAAGAAAAAA..78 Chick-cck--...--g-------c---t----------g--g----at77 Duck-cckTAATTTGTTGTCCTCTTTAAATTAGTGTTTTAAATTATAT118 Chick-cck-----------------cg---c-----------gc----117 Duck-cckCATGTATTTGATGTAAATTTGTCTGTAAGATTATACAATG158 Chick-cck------------------------------.....-----152 Duck-cckCAATATATACATATGCAGAATTTTCCAG..AAAATGTTTT196 Chick-cck----------------------------ga----------192 Duck-cckCTTTCTTTTGTGGTTTCTCATACGCTGA224 Chick-cck----------------------------220 3.討論     膽囊收縮素是1928年首先由Ivy和Oldberg在小腸粘膜提取液中發現，并最先證實它可引起膽囊收縮，故命名為膽囊收縮素。1943年Harper和Raper從小腸黏膜分泌物中提取了一種刺激胰腺酶分泌的刺激物質（CCK），稱之為腸促胰酶素因子，認為它是一種潛在的胰腺酶分泌刺激因子。后來，Dockray等又在羊腦中提取出CCK，發現它是目前在腦中含量較多的一種肽類物質，并證明是一種典型的腦-腸肽類物質[3,4]。CCK是一個在生物進化中被保留下來古老的肽類，多存在于脊椎動物如圓口類、硬骨魚類、兩棲類、爬行類、鳥類等動物腦和小腸黏膜的分泌細胞中，其中以大腦皮層濃度最高，甚至在無脊椎動物體內亦含有[5]。目前國內外還未曾有人報道從鴨體內分離提取CCK基因，本試驗成功的從30日齡的北京鴨體內克隆出CCK基因片斷，和雞的CCK核苷酸相比較，同源性為88.2％，證明其確實為CCK基因，這也為獲得鴨全長的CCK基因奠定了基礎。     作為胃腸激素和神經肽[6]，CCK廣泛分布于消化系統，中樞、外周神經系統，外周血液和一些組織器官中。消化系統中CCK主要以大分子形式存在，由主要分布于十二指腸及空腸上段的腸絨毛和腸腺上皮的Ⅰ細胞分泌，DannyM.Hooge等[7]研究表明CCK在雞體內，十二指腸含量最高，其次為空腸、回腸和腦皮質。雞的下丘腦、胰腺、膽囊及盲腸膜中也檢測到特異性結合物CCK-8S（CCK-8的硫酸鹽形式）。中樞系統中CCK以CCK-8活性片斷形式存在，其分泌細胞主要分布于室旁核與室上核。本次試驗初步探明北京鴨十二指腸和空腸含有CCK，但腺胃中卻未能擴出CCK基因，提示腺胃中可能沒有CCK存在。但有報道CCK分泌和動物的年齡有一定關系，不同年齡階段CCK分泌不同，故是否此次選取的30日齡鴨在此年齡階段無CCK分泌，還需進一步探討。     脾具有消化吸收運輸營養物質及水濕的功能，機體的各臟腑、四肢百骸、筋肉、皮毛，均有賴脾的運化以獲取營養。因此脾功能失常，會出現腹脹、腹瀉、營養不良等癥狀。而脾與胃腸激素的關系：劉芳等[2]研究表明，脾虛早期會導致組織和血漿CCK含量升高，胰液分泌增多，促進小腸運動和抑制胃運動作用加強，動物表現為納差、腹瀉；脾虛后期CCK含量下降，促進膽囊收縮和胰液分泌作用下降，對小腸運動刺激作用減小，動物表現為腹瀉停止，排便粘滯。同時多部位激素含量的觀察表明脾虛證時血漿、腸道和下丘腦組織中CCK的變化趨勢是不一致的，可推測不同組織和血漿中CCK對脾虛失健運的作用是不一致的。由此可見CCK可作為脾虛證的一個客觀性和特異性指標，因此通過探明鴨CCK基因序列，可以建立一種快捷的通過檢測CCK來評價動物脾虛病理狀況的方法。     健脾消食類中藥具有健脾益氣，促消化、助生長的作用。研究表明[8]健脾消食中藥黨參、山楂可促進胰液分泌，提高胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶活性，促進食物消化吸收，從而促進動物增長，提示健脾消食類中藥可能是通過對胃腸激素（CCK）的調節來達到促進胰腺外分泌。本試驗為從分子水平研究健脾消食中藥與胃腸激素之間關系提供理論基礎，也為進一步研究和開發中藥飼料添加劑奠定基礎。

寧衡

不錯的資料，不過給自己加分啊？