白頭翁素對LT致腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO升高的影響

貔貅

摘要：為了探討白頭翁在治療細菌性痢疾方面的藥理機制，通過體外培養腸黏膜微血管內皮細胞，采用硝酸還原酶法檢測各試驗組細胞上清液中NO含量，研究了白頭翁素對正常培養的腸黏膜微血管內皮細胞和LT刺激后的腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO的影響。研究結果顯示白頭翁素對正常腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO無明顯影響，但可顯著抑制LT引起的腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO升高。表明白頭翁素抑制LT刺激腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO，是白頭翁素的重要藥理機制。
關鍵詞：微血管內皮細胞；腸黏膜；LT；白頭翁素；NO
    白頭翁作為治療菌痢的要藥，其主要成分是白頭翁素。目前，對白頭翁素藥理機制的研究并不多見，一般認為主要在于抑菌[1]，對于其它的藥理作用尚不得而知。越來越多的研究表明，細菌毒素是引起腹瀉的罪魁禍首，而細菌毒素作用的主要靶細胞是腸黏膜微血管內皮細胞[2]。因此，阻斷細菌毒素對腸黏膜微血管內皮細胞的損傷，為抗細菌病藥物的研究提供了新的思路和方法。熱敏腸毒素（LT）是產毒素性大腸桿菌釋放的主要毒素，可直接導致腹瀉。本試驗在建立LT引起腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO升高病理模型的基礎上，研究了白頭翁素對其影響，以進一步闡明白頭翁素的抗腹瀉機制。
1材料與方法
1.1主要材料與試劑
腸黏膜微血管內皮細胞：本實驗室培養的第八代大鼠腸黏膜微血管內皮細胞[3]。
完全培養基：在DMEM培養液中按比例加入以下成份：15% FBS（Hyclone）、0.584mg/ml谷氨酰胺（Sigma）、1×105U/L注射用青霉素（華北制藥股份有限公司）、0.1g/L注射用鏈霉素（華北制藥股份有限公司）。
維持培養基：添加5％FBS，其它成份同完全培養基。
LT ：由北京農學院微生物實驗室制備、鑒定[4]。
白頭翁素：購自天津中醫藥研究所。
NO檢測試劑盒：購自深圳晶美生物工程公司。
1.2試驗方法
1.2.1腸黏膜微血管內皮細胞傳代培養：

    選取第七代腸黏膜微血管內皮細胞，進行傳代，平均接種于48孔培養板內，靜止培養。細胞定時計數，待數量增至1.0×105時，選取40孔細胞用于試驗。

1.2.2細胞分組：
將細胞按以下方案分為四組。
對照組：用維持培養基培養；
LT組：用含有10mg/ml LT的維持培養基培養；
白頭翁素組：用含有5mg /ml白頭翁素的維持培養基培養；
LT＋白頭翁素組：用含有10mg/ml LT的維持培養基培養1h后，再添加白頭翁素繼續培養。
1.2.3樣品采集和NO測定
    各組細胞分別培養3h、6h后，依次收集培養上清液（每組收集5孔），3000rp/m離心10min后，分別收集于小離心管中。按NO檢測試劑盒（硝酸還原酶法）操作說明，于530nm處檢測各樣品OD值，按公式計算NO水平。
1.3數據統計學處理    以平均數 ± 標準差表示，采用t檢驗進行顯著性分析。
2 結果與分析
    各組細胞分泌NO的量見附表，由表可知：（1）在3h和6h內，LT組細胞分泌NO量均極顯著高于對照組；（2）在3h和6h內，白頭翁素組細胞分泌NO的量與對照組之間差異均不顯著；（3）在3h和6h內，LT＋白頭翁素組細胞分泌NO量均極顯著低于LT組。
    以上結果表明：10mg/ml LT可刺激腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO升高；10mg/ml白頭翁素對正常培養的腸黏膜微血管內皮細胞NO的分泌無明顯影響；5mg /ml白頭翁素可顯著抑制LT引起的腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO升高。

附表.白頭翁素對LT刺激腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO的影響（±sμmol/L ，n=5）

Table: The effect of anemones on the level of NO in the rat intestinal mucous microvascular endothelial cells exposed under LT. （±sμmol/L ，n=5）

組別	劑量 mg/ml	3hNO μmol/L	6hNO μmol/L
對照組	0	21.43±1.34	16.60±1.26
LT組 白頭翁素組 LT＋白頭翁素組	10 5 10＋5	26.68±1.18* 21.22±2.18** 17.54±1.47Δ	34.77±1.43* 16.46±1.43** 16.39±1.01Δ

（在同一時間段，與對照組比較 *P<0.01，**P>0.05，與LT組比較ΔP<0.01。）
3．討論：
    LT是產毒素性大腸桿菌的主要毒力因子，以往的研究都集中于LT對腸黏膜上皮細胞功能的影響，并認為上皮細胞是LT的特異性靶細胞[5]。隨著對內皮細胞功能的不斷深入，人們開始逐漸認識到腸黏膜微血管內皮細胞在細菌毒素引起的腸道疾病中起十分重要的作用。有人認為，由細菌毒素引起的腸道微血管內皮細胞反應異常，如微血管通透性增加、中性粒細胞聚集及微血管收縮等，是導致腸炎的重要致病機制[6]?？紤]到腸黏膜微血管緊接上皮細胞層，是循環系統的末端，其通透性升高是導致黏膜水腫和水鹽流入腸腔的前提，因此，我們推測，腸毒素除了損傷腸黏膜上皮細胞，甚至更為重要的是損傷到腸黏膜內皮細胞，引起腸道通透性升高，從而導致腹瀉。本試驗結果LT能顯著刺激腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO升高，結合NO的增加微血管通透性效應，證實了我們的觀點。
    白頭翁是治療細菌性痢疾的重要中藥，對其有效成分作用機理的研究無疑有助于臨床用藥。本試驗調查了白頭翁素對正常培養的腸黏膜微血管內皮細胞以及對LT刺激后的腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO的影響。結果表明，5mg /ml白頭翁素對正常腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO無明顯影響，但可抑制LT引起的腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO升高。推測這種抑制作用，可通過以下4種途徑實現：①直接破壞LT的活性結構；②與LT競爭腸黏膜內皮細胞上的受體；③參與LT刺激腸黏膜微血管內皮細胞合成和分泌NO的中間過程；④直接影響NO的分泌。從LT對正常培養腸黏膜內皮細胞分泌NO無明顯影響的結果，可以排除④的可能性，但確切的機制尚需進一步研究。據研究報道，NO可作為內皮細胞損傷的標志物[7]，因此可以推論，白頭翁素對LT引起的腸黏膜微血管內皮細胞損傷具有保護作用。這對于防止腸黏膜微血管內皮細胞免受LT造成損傷和防治大腸桿菌病具有重要意義。