穿心蓮內(nèi)酯抗SLT-Ⅱe致大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO及ET-1的影響

貔貅

志賀樣毒素Ⅱ型變異體（SLT-Ⅱe）是豬水腫病（ED）的主要致病因子[1,2]。目前的研究顯示：SLT-Ⅱe致病機制是通過對其靶細胞-——腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞的刺激，引發(fā)細胞分泌機能的改變，釋放各種細胞因子影響細胞的正常形態(tài)和功能[3]。NO與ET-1是由血管內(nèi)皮細胞分泌的一對作用相反的因子，分別有舒張和收縮血管的作用[4,5]。血管內(nèi)皮細胞通過調(diào)控NO與ET-1的釋放平衡來調(diào)節(jié)血管的功能[6]。

　　穿心蓮內(nèi)酯為爵床科植物穿心蓮的有效成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，穿心蓮內(nèi)酯具有調(diào)節(jié)血管舒縮[7]、抗血栓及血小板聚集[8]等多種作用，對機體內(nèi)微循環(huán)的調(diào)節(jié)具有重要意義。本試驗旨從大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞（RIMMVECs）分泌NO與ET-1的角度，探討SLT-Ⅱe具體的致病機制以及穿心蓮內(nèi)酯抗SLT-Ⅱe損傷RIMMVECs的作用機制。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　DMEM（Gibico）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Gibico）；SLT-Ⅱe粗提物（揚州大學(xué)微生物實驗室提供）；穿心蓮內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞（北京農(nóng)學(xué)院實驗室提供）；NO試劑盒（深圳晶美公司）；ET-1試劑盒（上海尚柏生物公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞傳代培養(yǎng)

　　選取第10代的細胞進行消化, 所得細胞液用完全培養(yǎng)基稀釋,將細胞密度調(diào)整到5 ×104 個?mL-1, 充分混勻后接種至96孔的培養(yǎng)板中,每個孔接種0.2 mL，然后置入CO2 培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)48 h。

　　1.2.2試驗前細胞計數(shù)

　　培養(yǎng)48h 后，定時消化三孔細胞作計數(shù)，當(dāng)細胞數(shù)量增至1×105 個?mL-1 時，用于實驗。

　　1.2.3分組方案

　　各孔細胞分為空白對照組、SLT-Ⅱe組、SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組和SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯2組?？瞻讓φ战M加DMEM維持培養(yǎng)基，其余三組加含有10 μg?mL-1 SLT-Ⅱe的DMEM維持培養(yǎng)基，2 h后再向SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組和SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯2組分別加入終濃度為5 μg?mL-1、20 μg?mL-1的穿心蓮內(nèi)酯液，置于CO2 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

　　1.2.4取樣

　　每組分6 h、12 h、18 h三個觀測點，在各時間點取樣測定細胞上清液中NO和ET-1的含量。

　　1.2.5測定

　　NO的測定用硝酸還原酶法,按照試劑盒說明操作,使用分光光度計于530 nm 處檢測。

　　ET-1的測定用ELISA法，按照試劑盒說明操作，使用酶標(biāo)儀于450 nm 處檢測。

　　1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計

　　采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理。

　　試驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，試驗組間差異采用t檢驗法。

　　2結(jié)果

　　2.1不同濃度穿心蓮內(nèi)酯抗SLT-Ⅱe對RIMMVECs分泌NO的影響

　　表1　不同濃度穿心蓮內(nèi)酯抗SLT-Ⅱe對RIMMVECs分泌NO的影響（治療組）（±S μmol?L-1）(n＝3)

組別	6 h	12 h	18 h
空白對照組	12.82±1.75	14.73±2.84	16.45±2.31
SLT-Ⅱe組	16.45±0.88	19.50±3.19	32.68±2.29**
SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組	15.49±2.30	21.22±2.06**	31.34±2.82**
SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯2組	17.02±3.26	15.69±2.32	16.25±4.8△

　　注：與空白組對照，** p＜0.01，* p＜0.05；SLT-Ⅱe組與SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組，SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯
　　2組對照，△△ p＜0.01，△ p＜0.05。
　　2.2不同濃度穿心蓮內(nèi)酯抗SLT-Ⅱe對RIMMVECs分泌ET-1的影響
　　表2 不同濃度穿心蓮內(nèi)酯抗SLT-Ⅱe對RIMMVECs分泌ET-1的影響（治療組）（±S pg?mL-1）(n＝3)
　　

組別	?6 h	12 h	18 h
空白對照組	1.33±0.55	2.32±0.45	2.91±0.61
SLT-Ⅱe組	10.27±1.21**	9.56±1.41**	8.35±0.89**
SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組	10.31±0.81**	9.93±1.33**	7.71±0.59**
SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯2組	12.47±1.19**△△	13.08±0.53**△△	13.67±0.61**△△

　　注：與空白組對照，** p＜0.01，* p＜0.05；SLT-Ⅱe組與SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組、SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯
　　2組對照，△△ p＜0.01，△ p＜0.05。
　　3討論
　　NO與ET-1之間均以cGMP 為中介，兩者之間存在著反饋性調(diào)節(jié)[9]，共同維持著正常的血管舒縮。兩者分泌量一旦發(fā)生紊亂，勢必破壞機體內(nèi)正常微循環(huán)的進行。由表1和表2看出，SLT-Ⅱe組中NO的分泌量僅僅在第18 h極顯著高于空白組，在第6、12 h與空白組無顯著差異；ET-1在第6、12、18 h與空白組相比均極顯著升高。分析原因可能是，微血管內(nèi)皮細胞在受到SLT-Ⅱe刺激后，通過自身的保護機制發(fā)揮作用，ET-1首先開始分泌，以抑制NO—cGMP途徑，使NO的分泌量在12 h內(nèi)未顯著升高，細胞內(nèi)的cGMP 水平也未明顯升高。作用一段時間后，SLT-Ⅱe逐漸發(fā)揮毒性作用，而細胞自身的保護力逐漸下降，出現(xiàn)了失代償?shù)臓顩r，ET-1逐漸無法遏制NO的合成，NO大量分泌，ET-1反被NO抑制，分泌量呈逐漸下降的趨勢。NO在18 h達到分泌高峰，并通過NO—cGMP 途徑，使細胞內(nèi)的cGMP 水平增高而導(dǎo)致血管舒張，進而使機體發(fā)生水腫。由此我們認為，SLT-Ⅱe致病機制主要是作用其靶細胞——微血管內(nèi)皮細胞后，細胞通過自身保護力首先分泌ET-1來抑制NO分泌量的升高，但最終毒素的持續(xù)作用使細胞失去自身保護力，NO大量分泌導(dǎo)致微血管舒張，間隙增大，組織液進入組織間隙的量增多，造成組織水腫。在SLT-Ⅱe的致病機制中，NO是主要的致病因子，而ET-1作為與NO作用相反的細胞因子，在一定程度上可能起著保護微血管內(nèi)皮細胞的作用。
　　穿心蓮內(nèi)酯目前已經(jīng)成為抗心血管疾病常用中藥之一。有研究表明，穿心蓮內(nèi)酯具有調(diào)節(jié)血管舒縮的作用[10]。由表1和表2可以看出，SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組（5 μg?mL-1穿心蓮內(nèi)酯）中NO的分泌量逐漸升高，且在12、18 h高于空白組，差異極顯著，較SLT-Ⅱe組差異不顯著；ET-1分泌量各時間段均較空白組高，且呈略微下降趨勢，較SLT-Ⅱe差異均不顯著。分析原因可能是，5 μg?mL-1穿心蓮內(nèi)酯對SLT-Ⅱe作用后的微血管內(nèi)皮細胞保護力較弱或沒有保護力。5 μg?mL-1穿心蓮內(nèi)酯作用后，微血管內(nèi)皮細胞迅速分泌ET-1，但是ET-1的分泌量較SLT-Ⅱe組沒有顯著的升高，無法抑制NO—cGMP 途徑，NO大量分泌，cGMP水平升高從而導(dǎo)致細胞的損傷。SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯2組（20 μg?mL-1穿心蓮內(nèi)酯）中NO分泌量略有降低，在各時間段與空白組均無顯著差異，而在18 h顯著低于SLT-Ⅱe組；ET-1分泌量略有升高，各時間段極顯著高于空白組，且極顯著高于SLT-Ⅱe組。分析原因可能是，20 μg?mL-1可以使ET-1在18 h內(nèi)均保持較高的分泌量，抑制了NO—cGMP 途徑，使NO無法大量分泌，且分泌量能夠回復(fù)到生理狀態(tài)時的水平，進而起到保護微血管內(nèi)皮細胞的作用。近年來穿心蓮內(nèi)酯對心血管方面的藥理研究很多，但試驗多以主動脈、臍靜脈等為研究對象，對微血管方面的藥理作用研究甚少。本試驗的結(jié)果表明，不僅僅是對大動脈、大靜脈，穿心蓮內(nèi)酯對機體的微血管同樣有一定的調(diào)節(jié)作用。雖然具體的作用機制尚不清楚，但基本上可以認定，穿心蓮內(nèi)酯是通過刺激細胞分泌對細胞有保護作用的ET-1，來抑制SLT-Ⅱe刺激后分泌的主要的致病因子——NO的合成，從而達到治療效果。這一結(jié)論再次驗證了之前“在SLT-Ⅱe的致病機制中，NO是主要的致病因子，ET-1對內(nèi)皮細胞有一定的保護力”的推測。
　　綜上所述，NO分泌量的升高是SLT-Ⅱe引起腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞損傷的直接因素。微血管內(nèi)皮細胞受到 SLT-Ⅱe的作用，通過自身的保護機制，首先使ET-1快速升高，以抑制初期NO分泌量的升高，隨后NO開始大量分泌而導(dǎo)致細胞損傷。此外，在18 h時間段內(nèi)，20 μg?mL-1穿心蓮內(nèi)酯可以使SLT-Ⅱe作用后的ET-1保持穩(wěn)定的分泌，NO分泌量不顯著升高，從而對SLT-Ⅱe所致微血管損傷及微循環(huán)的障礙起到一定的治療作用。