附紅細(xì)胞體病羊血清NO、紅細(xì)胞免疫功能的變化

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附紅細(xì)胞體病羊血清NO、紅細(xì)胞免疫功能的變化 姜代勛*1，甄士偉2，黃會(huì)嶺1 （1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定：071001；2.河北廊坊市畜牧局，廊坊：065001）

摘要：選用附紅細(xì)胞體病羊和健康羊，分成患病組和健康對(duì)照組，每組10只，分別自頸靜脈采血，用硝酸還原酶法測(cè)定血清一氧化氮（NO）含量，用郭峰法檢測(cè)紅細(xì)胞免疫功能（包括紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率（C3bRR）和免疫復(fù)合物花環(huán)率（ICR））。結(jié)果表明：附紅細(xì)胞體病羊血清NO含量異常升高（P＜0.01），而紅細(xì)胞免疫功能明顯下降（P＜0.01）。 關(guān)鍵詞：附紅細(xì)胞體病；NO；紅細(xì)胞免疫功能；羊     附紅細(xì)胞體病（Eperythrozoonosis）是由附紅細(xì)胞體（Eperythrozoon）引起的一種人畜共患傳染病。該病主要呈隱性感染，平均隱性感染率可達(dá)86.53%[1]，能造成家畜體質(zhì)衰弱，繁殖能力下降，乳、肉產(chǎn)量減少，易繼發(fā)其它傳染病等。在某些應(yīng)激因素下，呈急性暴發(fā)，病畜表現(xiàn)高熱、黃疸、貧血等癥狀，嚴(yán)重的可引起大批死亡，已給我國(guó)乃至世界的動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，隨著家畜附紅細(xì)胞體病的頻繁暴發(fā)，有關(guān)該病的研究，已引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者和臨床獸醫(yī)工作者的高度重視。 當(dāng)前，對(duì)動(dòng)物附紅細(xì)胞體病治療的報(bào)道較多，而研究其發(fā)病機(jī)制的較少，且血清NO、紅細(xì)胞免疫功能與附紅細(xì)胞體病的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。檢測(cè)血清NO、紅細(xì)胞免疫功能的變化可作為研究患病動(dòng)物免疫功能及發(fā)病機(jī)制的一個(gè)有意義的指標(biāo)。     1 材料與方法     1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物     小尾寒羊，成年，雌性，1～2歲，分為患病組和對(duì)照組，每組10只羊。其中患病組臨床上具有貧血、黃疸、發(fā)熱等癥狀，耳靜脈采血，經(jīng)瑞氏染色，在顯微鏡下觀察到附紅細(xì)胞體。對(duì)照組臨床觀察健康，采血鏡檢未見(jiàn)附紅細(xì)胞體。     1.2 血樣采集與處理     患病組和對(duì)照組分別自頸靜脈采血，共2管：一管肝素（30Iu/mL全血）抗凝，測(cè)定紅細(xì)胞C3bRR、ICR；另一管分離血清，檢測(cè)NO含量。     1.3 NO含量測(cè)定     采用硝酸還原酶法。試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。     1.4 紅細(xì)胞免疫功能測(cè)定     采用郭峰法[2]：包括紅細(xì)胞C3bRR，ICR（所用紅免試劑購(gòu)自上海長(zhǎng)海醫(yī)院）。     1.5 數(shù)據(jù)處理     采用Microsoft Excel軟件單因素方差分析，用t-檢驗(yàn)法檢測(cè)兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。     2 結(jié)果     2.1 血清NO含量變化     由表1可知，患病組血清NO含量顯著高于對(duì)照組，差異極顯著（P＜0.01）。 表1對(duì)照組與患病組血清NO檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)指標(biāo) 對(duì)照組 患病組 NO（μmol/L） 14.98±1.04B 26.42±1.66A 注：同一行比較，大寫字母不同者差異極顯著（P＜0.01＝，下同。     2.2 紅細(xì)胞免疫功能變化     根據(jù)表2，患病組與對(duì)照組比較，紅細(xì)胞C3bRR、ICR均顯著降低，差異極顯著（P＜0.01）。 表2對(duì)照組與患病組紅細(xì)胞免疫功能檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)指標(biāo) 對(duì)照組 患病組 C3bRR（%） 11.92±1.04A 7.82±0.56B ICR（%） 9.79±0.62A 6.81±0.70B     3 討論     內(nèi)源性NO是在細(xì)胞內(nèi)生成的一種小分子自由基，目前已知多種細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和血小板等均能以L-精氨酸為底物，在一氧化氮合酶（NOS）的作用下，生成NO。NOS有兩種，即原生型NOS（cNOS）和誘導(dǎo)型NOS（iNOS）。iNOS一般情況下在體內(nèi)不表達(dá)，只有在受到細(xì)胞因子（如TNF、IFN-r、IL-1B等）或細(xì)菌內(nèi)毒素的刺激下才表達(dá)，并催化生成大量的NO[3]。而在非病理情況下，動(dòng)物體內(nèi)iNOS不表達(dá)，血清中NO僅起生理調(diào)節(jié)作用。     在免疫反應(yīng)中，NO能增強(qiáng)非特異性免疫功能，主要表現(xiàn)為殺滅微生物及瘤細(xì)胞作用[4]。已發(fā)現(xiàn)NO對(duì)多種病原體如蠕蟲、錐蟲、真菌、原蟲、細(xì)菌及病毒有直接或間接的使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或殺傷作用。而且動(dòng)物在感染寄生蟲病后，血清NO含量均出現(xiàn)升高現(xiàn)象[5-8]。     附紅細(xì)胞體既有原蟲的特點(diǎn)，又有立克次氏體目的特性[9]，動(dòng)物患病后血清NO含量有何變化尚未見(jiàn)報(bào)道。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，患附紅細(xì)胞體病羊存在血清NO升高的異常變化。患羊血液內(nèi)存在著大量的附紅細(xì)胞體，可能激活羊機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致大量的炎性因子釋放，誘導(dǎo)了宿主多種類型細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)內(nèi)的iNOS活性及表達(dá)，從而催化生成大量NO。iNOS催化生成的NO量大，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，且主要在病理情況下抑制或殺死入侵病原體[10,11]。因此，患羊血清NO含量的升高可能是機(jī)體的一種積極的防御性反應(yīng)。     但機(jī)體內(nèi)源性NO生成過(guò)多也會(huì)對(duì)組織細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用[12]。NO作為肝臟中巨噬細(xì)胞釋放的主要炎性介質(zhì)之一，通過(guò)介導(dǎo)枯否氏細(xì)胞的毒性，造成肝細(xì)胞的損傷[13]。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，患病組病羊存在血清NO含量顯著升高的異常變化，這可能是出現(xiàn)黃疸癥狀的原因之一。此外，一方面大量的附紅細(xì)胞體消耗機(jī)體營(yíng)養(yǎng)（葡萄糖），另一方面高濃度的NO能夠抑制消化系統(tǒng)[14]，使病羊食欲降低甚至廢食，故患附紅細(xì)胞體病羊表現(xiàn)消瘦、厭食等癥狀。     紅細(xì)胞C3bRR和ICR可作為紅細(xì)胞天然免疫粘附功能的指標(biāo)，如兩項(xiàng)指標(biāo)都低下，判為原發(fā)性紅細(xì)胞免疫功能低下，為紅細(xì)胞膜C3b受體遭到破壞或遺傳因素缺陷及其它原因所致[2]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，患病組羊紅細(xì)胞C3bRR、ICR與對(duì)照組比較，其花環(huán)率均顯著降低，因而患病羊?yàn)樵l(fā)性的紅細(xì)胞免疫功能低下。此時(shí)紅細(xì)胞已不能粘附過(guò)量的循環(huán)免疫復(fù)合物，是紅細(xì)胞免疫功能低下失代償期，表明C3b直接受損，粘附活性喪失。     羊患附紅細(xì)胞體病時(shí)，大量附紅細(xì)胞體附著于紅細(xì)胞表面，必然屏蔽紅細(xì)胞膜上的C3b受體；同時(shí)寄生附紅細(xì)胞體的紅細(xì)胞表面出現(xiàn)皺褶、突起，而衰老的附紅細(xì)胞體可裂解為碎片釋放入血漿，在原來(lái)寄生的部位出現(xiàn)凹陷、空洞，引起紅細(xì)胞膜的損傷[15]。紅細(xì)胞膜含有豐富的磷酸多不飽和脂肪酸，且所處的環(huán)境經(jīng)常與自由基相接觸，極易受到自由基（如NO）的損傷[16]。以上各種破壞紅細(xì)胞膜的因素必然導(dǎo)致紅細(xì)胞膜上C3b受體數(shù)目減少，活性降低，因而造成紅細(xì)胞免疫功能低下。此外，附紅細(xì)胞體的空間位阻也可能影響到紅細(xì)胞與免疫復(fù)合物粘附形成花環(huán)。     機(jī)體內(nèi)的免疫復(fù)合物可通過(guò)激活補(bǔ)體與紅細(xì)胞膜上的C3b受體相連，然后運(yùn)送到肝臟，在肝臟受到血漿調(diào)節(jié)蛋白Ｉ因子的作用使C3b轉(zhuǎn)變?yōu)镃3dg。這樣，C3b受體引導(dǎo)免疫復(fù)合物到預(yù)定的器官進(jìn)行處理，從而防止免疫復(fù)合物在腎臟及小血管內(nèi)沉積，引起疾病[17]。羊患附紅細(xì)胞體病后，紅細(xì)胞免疫功能低下，攜帶免疫復(fù)合物的能力降低，血液中免疫復(fù)合物濃度升高，從而易引起一些免疫復(fù)合物性疾病。     綜上所述，羊患附紅細(xì)胞體病后可能通過(guò)誘導(dǎo)iNOS生成高濃度的NO，而附紅細(xì)胞體的寄生和高濃度的NO對(duì)紅細(xì)胞膜的損傷引起紅細(xì)胞免疫功能降低，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

寧衡

這個(gè)還是太專業(yè)了吧？