復(fù)方中藥制劑“球?qū)帯睂?duì)感染柔嫩艾美耳球蟲雛雞血漿

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復(fù)方中藥制劑“球?qū)帯睂?duì)感染柔嫩艾美耳球蟲雛雞血漿 SOD、MDA含量的影響 張 鐵1 王春光1 宮新城1 苑方重1 張國(guó)磊1 翟向和1 鐘秀會(huì)2*    (1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院 河北定州 073000 2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 河北保定 071000 *通訊作者）

摘要：用青蒿、常山等組成復(fù)方中藥制劑“球?qū)帯保?duì)其進(jìn)行超微粉碎加工成微粉制劑。按不同比例添加于飼料中，飼喂人工感染柔嫩艾美耳球蟲的雛雞，以磺胺喹啉鈉為對(duì)照，在感染后第8d剖殺，檢測(cè)血漿中SOD、MDA的含量，結(jié)果表明，用藥各組與陽性對(duì)照組相比均能增加雛雞血漿SOD含量；降低血漿丙二醛（MDA）含量。說明所試中藥可以增加機(jī)體清除自由基的能力，減少自由基對(duì)機(jī)體的損傷，從而保護(hù)機(jī)體。     關(guān)鍵詞：中藥；E.tenella；超微粉碎；SOD； MDA     雞球蟲病是由艾美耳屬球蟲寄生于雞腸道所引起的、最常見的一種原蟲病，呈世界性分布。據(jù)Bhoal[1]報(bào)道，全世界抗球蟲藥的年消費(fèi)是33億美元。我國(guó)養(yǎng)雞數(shù)為30億～60億羽，按郁明發(fā)[2]報(bào)道的每羽肉仔雞平均耗用抗球蟲藥費(fèi)為0.2～0.3元估算，我國(guó)每年用于雞的抗球蟲藥費(fèi)用達(dá)6億～18億元人民幣。該病多發(fā)生于15～50日齡的雛雞，發(fā)病率和死亡率均較高。集約化養(yǎng)雞場(chǎng)則是球蟲病暴發(fā)的最適宜場(chǎng)所，其發(fā)病率為50%～70%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)80%，給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。     該病主要依靠化學(xué)藥物進(jìn)行防治，但球蟲耐藥性問題給臨床防治帶來很大麻煩[3]。中藥具有毒副作用小和抑殺球蟲、增強(qiáng)雞體免疫功能及促生長(zhǎng)等特點(diǎn)，尤其是雞球蟲對(duì)其不易產(chǎn)生耐藥性，因而有廣闊的發(fā)展前景。將中藥進(jìn)行超微粉碎后，藥物的吸收率大大提高，減少劑量，可明顯提高制劑的藥效學(xué)活性[4]，節(jié)省原料，提高效率，降低成本。     近年來，自由基在生物體系中的作用已成為生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。體內(nèi)產(chǎn)生的自由基以氧自由基（Oxygen Free Radicals, OFR）為主，約占95%，對(duì)機(jī)體危害亦最大。在正常的生理狀況下，生物體內(nèi)的自由基不斷產(chǎn)生，也不斷被清除，維持在低水平的平衡濃度。少量的自由基對(duì)機(jī)體是有益的，但過量的自由基可對(duì)機(jī)體造成損傷，是構(gòu)成很多疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。有資料證明，球蟲感染后，雞體內(nèi)的氧自由基生成反應(yīng)加劇，說明氧自由基參與了球蟲的致病過程[5，6，7]。     本試驗(yàn)中用青蒿、常山等組成復(fù)方中藥制劑“球?qū)帯?，并?duì)其進(jìn)行超微粉碎加工成微粉制劑，按不同比例添加于飼料中，飼喂人工感染柔嫩艾美耳球蟲的雛雞，分別檢測(cè)血漿中MDA、SOD的含量。初步探討球蟲感染和抗球蟲中藥對(duì)機(jī)體氧自由基變化的關(guān)系，進(jìn)一步闡明中藥抗球蟲機(jī)理和為新型抗球蟲藥物的研制提供依據(jù)。     1 材料與方法     1.1 試驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自定州市二賢種雞場(chǎng)的1日齡海蘭灰蛋公雛。購(gòu)進(jìn)后于無球蟲的消毒鐵絲籠內(nèi)隔離飼養(yǎng)至23日齡，經(jīng)糞便檢查，確認(rèn)無球蟲感染后作為試驗(yàn)用雞。     1.2 球蟲卵囊     試驗(yàn)用柔嫩艾美耳（E.tenella）卵囊由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院寄生蟲室惠贈(zèng)。孢子化后，用15日齡小雛雞復(fù)壯，再經(jīng)孢子化后，記數(shù)，備用。     1.3主要試劑與藥品     試驗(yàn)所用中藥（青蒿、常山、鴉膽子、硫磺粉、地錦草、仙鶴草、金雞納、黨參、甘草）購(gòu)于定州市時(shí)代藥房；丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物試劑公司，批號(hào)：20040227)，超氧化物歧化酶(SOD) 測(cè)定試劑盒(南京建成生物試劑公司，批號(hào)：20040227)。     1.4主要儀器設(shè)備     普通中藥粉碎機(jī)；倍力BMF-6型超微粉碎機(jī)（濟(jì)南倍力粉工程技術(shù)有限公司）；UV-9100分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）。     1.5 試驗(yàn)方法     1.5.1藥物的制備     將青蒿、常山、鴉膽子、硫磺粉、地錦草、仙鶴草、金雞納、甘草8味中藥按一定配比組成復(fù)方后，分別經(jīng)普通粉碎機(jī)和超微粉碎機(jī)加工粉碎后備用。     普通粉（即粗粉）要求：全部藥物通過80目篩（篩孔直徑177微米）。超微粉碎（即微粉）要求：全部藥物通過625目篩（篩孔直徑20微米）。     1.5.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)     從經(jīng)預(yù)備期飼養(yǎng)至23日齡的雛雞中選取健康雛雞115只，隨機(jī)分為7組，每組15只，稱量記錄體重。分別為不感染不給藥陰性對(duì)照組；感染不給藥陽性對(duì)照組；感染給西藥組（磺胺喹啉鈉，飲水濃度100ppm）；感染給中藥普通粉碎（2%添加）組；感染給中藥微粉（2%添加）組；感染給中藥微粉（1%添加）組；感染給中藥微粉（0.5%添加）組。并于分組后的次日每組分別經(jīng)口感染柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊4.0×104個(gè)/只，常規(guī)飼養(yǎng)，當(dāng)攻蟲組出現(xiàn)第一堆血便時(shí)，開始添加藥物。     1.5.3 盲腸組織病理學(xué)檢查     盲腸組織經(jīng)波恩液（25%的福爾馬林+75%飽和苦味酸飽和溶液）固定48h→70%酒精（2h）→80%酒精（2h）→85%酒精(2h)→90%酒精(2h)→95%酒精(2h)→100%酒精Ⅰ(1h)→100%酒精Ⅱ(1h)→(二甲苯與乙醇的等比溶液)30min→二甲苯20min→二甲苯20min→石蠟Ⅰ30min→石蠟Ⅱ30min→石蠟Ⅲ20min→連續(xù)切片4μm，隔3取1，進(jìn)行HE染色，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察病理組織變化。     1.5.4 血漿超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA含量的測(cè)定     1.5.4.1 超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定     采用黃嘌呤氧化酶法，通過黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2—），后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值，通過計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD含量。     各組分別于感染后第8d，采血分離血漿，然后按試劑盒所示步驟進(jìn)行。     1.5.4.2 丙二醛（MDA）的測(cè)定     硫代巴比妥酸（TBA）法，過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰。用可見分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。通過計(jì)算MDA含量。     各組分別于感染后第8d，采血分離血漿，然后按試劑盒所示步驟進(jìn)行操作。     1.5.5 抗球蟲指數(shù)（ACI）的測(cè)定[8]     分別計(jì)算用藥各組的增重率、存活率、病變值和卵囊值。     抗球蟲指數(shù)（ACI）=（增重率+存活率）—（病變值+卵囊值）     2 結(jié)果     2.1盲腸組織病理學(xué)變化     感染后4～7d，是病變最嚴(yán)重的階段。主要表現(xiàn)為：中、后段盲腸粘膜深層嚴(yán)重出血，大量粘膜上皮脫落，嚴(yán)重者可見整個(gè)粘膜幾乎完全脫落，腸腺破壞，其表面被覆大量脫落的變性、壞死的上皮細(xì)胞和紅細(xì)胞，以及許多大型第2代裂殖體。粘膜下層顯著充血、水腫及淋巴細(xì)胞與嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，小血管壁發(fā)生纖維素樣變，肌層亦有少量淋巴細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，漿膜下小血管充血或出血。未脫落粘膜的固有膜中，聚集有許多大型第2代裂殖體，含有許多香蕉形裂殖子，蟲體周圍有淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)。     感染后6d，可見腸腺上皮中寄生有配子體，成熟大、小配子體寄生于絨毛上皮和腸腺上皮中，有時(shí)可見腸腺完全為配子體占據(jù)。     用藥組中以微粉組（2%）、粗粉組（2%）、微粉組（1%）病變最為輕微，微粉組（0.5%）、西藥組較為嚴(yán)重。     2.2 各組藥物的抗球蟲指數(shù)（ACI）     通過公式計(jì)算用藥各組的ACI，以微粉組（2%）最高為193.73，粗粉組（2%）和微粉組（1%）接近分別為181.64和182.78，微粉組（0.5%）為152.35，西藥組最低為128.92。     2.3各組藥物對(duì)感染E.tenella球蟲雛雞血漿超氧化物歧化酶（SOD）含量的影響     感染球蟲的各組在感染的第8d時(shí)，用藥各組與陽性對(duì)照組相比均能增加雛雞血漿SOD含量，其中微粉組（1%）、粗粉組（2%）、微粉組（2%）三組與陽性對(duì)照組差異極顯著（p<0.01）；與陰性對(duì)照組差異顯著（p<0.05）；微粉組（1%）與粗粉組（2%）兩組之間差異不顯著；微粉組（0.5%）、西藥組兩組與陽性對(duì)照組差異顯著（p<0.05）；兩組之間差異不顯著。結(jié)果見表1。 表1 血漿SOD含量檢測(cè)結(jié)果（NU/ml） 試驗(yàn)組 各組平均數(shù) 差異顯著（p<0.05） 差異極顯著（p<0.01） 陽性對(duì)照組 155.8±4.6 a A 微粉組（0.5%） 158.3±5.1 b A 西藥組 158.6±5.6 b A 粗粉組（2%） 165.8±8.3 c B 微粉組（1%） 167.5±6.9 cd B 微粉組（2%） 169.4±6.6 d BC 陰性對(duì)照組 172.5±9.3 e C        注：含有不同小寫字母者差異顯著（p<0.05），含有不同大寫字母者，差異極顯著（p<0.01）。下同     2.4 各組藥物對(duì)感染E.tenella球蟲雛雞血漿丙二醛（MDA）含量的影響     感染球蟲的各組在感染的第8d時(shí)，用藥各組血漿丙二醛（MDA）含量與陽性對(duì)照組相比均有所降低，其中粗粉組（2%）、微粉組（2%）兩組與陽性對(duì)照組差異極顯著（p<0.01）；微粉組（2%）與陰性對(duì)照組差異不顯著；微粉組（1%）與粗粉組（2%）兩組之間差異不顯著。西藥組與陽性對(duì)照組差異不顯著。結(jié)果見表2。 表2 血漿MDA含量檢測(cè)結(jié)果（umol/ml） 試驗(yàn)組 各組平均數(shù) 差異顯著（p<0.05） 差異極顯著（p<0.01） 陰性對(duì)照組 2.73±0.18 a A 微粉組（2%） 2.89±0.19 ab A 粗粉組（2%） 3.07±0.25 b A 微粉組（1%） 3.19±0.28 bc AB 微粉組（0.5%） 4.04±0.29 c B 西藥組 4.12±0.42 cd B 陽性對(duì)照組 4.74±0.43 d B     3 討論     在生理情況下，體內(nèi)氧自由基（Oxygen Free Radicals, OFR）濃度極低并處于平衡狀態(tài)，不僅對(duì)機(jī)體無害，還有獨(dú)特的生理作用，如有助于吞噬細(xì)胞殺滅有害的微生物等[9,10]。在疾病的情況下，機(jī)體體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過多或機(jī)體清除OFR能力減弱，則可產(chǎn)生丙二醛（MDA）等，對(duì)機(jī)體有較強(qiáng)的毒性作用，致使組織損傷而發(fā)生疾病[11,12] 。另外，OFR通過引發(fā)脂質(zhì)過氧化、損傷蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子物質(zhì)以及其它方式，造成組織細(xì)胞損傷，影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，從而促進(jìn)疾病的發(fā)生與發(fā)展[13,14]。     大量資料表明，生物體內(nèi)OFR雖然不斷地產(chǎn)生，但也不斷地被清除。氧自由基的清除涉及的酶有超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）等[15，16，17]。     因此SOD含量的高低間接反映機(jī)體清除自由基的能力，MDA含量的高低間接反映機(jī)體受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度。     試驗(yàn)中陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，血漿SOD含量和血漿MDA含量均為差異極顯著（p<0.01），說明雞在感染E.tenella過程中機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物，如MDA等以及新的氧自由基，引起細(xì)胞損傷。結(jié)果與鄭明學(xué)[6]，聶奎[7]報(bào)道的結(jié)果一致。     本試驗(yàn)中感染球蟲的各組在感染的第8d時(shí)，用藥各組與陽性對(duì)照組相比均能增加雛雞血漿SOD含量，降低血漿丙二醛（MDA）含量。具體的作用機(jī)理可能是方中含有抗球蟲的中藥常山、青蒿等，藥物通過抑制球蟲在雞體內(nèi)的增殖，從而保護(hù)機(jī)體清除自由基的能力，減少自由基對(duì)機(jī)體的損傷，降低球蟲感染過程對(duì)機(jī)體的致病作用，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體；另外試驗(yàn)方劑中含有地錦草，據(jù)曹瑞珍[18]報(bào)道，地錦草提取物可明顯提高小鼠血液SOD活性，降低MDA含量。     通過盲腸組織病理切片和各組藥物的抗球蟲指數(shù)分析，用藥組中以微粉組（2%）盲腸病變最為輕微，抗球蟲指數(shù)（193.73）最高，雛雞血漿SOD含量最高，而血漿丙二醛（MDA）含量最低；西藥組盲腸病變最為嚴(yán)重，抗球蟲指數(shù)（128.92）最低，雛雞血漿SOD含量最低，血漿丙二醛（MDA）含量最高。因此可見盲腸病變與血漿SOD含量呈負(fù)相關(guān)，與血漿丙二醛（MDA）含量成正相關(guān)。     綜合分析試驗(yàn)各組的盲腸病變、抗球蟲指數(shù)、雛雞血漿SOD、MDA含量等指標(biāo)，粗粉組（2%）和微粉組（1%）差異均不顯著。所以從添加劑量考慮，以微粉組（1%）為最經(jīng)濟(jì)、最合理的添加劑量，證明中藥超微粉碎可以減少添加量，只為粗粉用藥量的1/2。