菊粉酶研究進展及應用

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菊粉酶研究進展及應用

菊粉最早是從菊科植物中分離出來而得名。菊粉（inulin）是一種有呋喃構形的d一果糖經β-2，l糖苷鍵脫水聚合而成，且在果糖殘基（f）末端連有一個葡萄糖殘基（g）的直鏈結構多糖，是最簡單的一類果聚糖，簡寫為gfn（edelman等，1968）。此外，emst等（1995）報道，菊粉還含有少量另一類果聚糖（inulonose）即末端無連有g的果聚糖。

菊粉酶（inulinase）是能夠水解β－2，l－d一果聚糖果糖苷鍵的一類水解酶，學名β－2，l－d一果聚糖酶，又叫β一果聚糖酶，2，l－d一果聚糖水解酶（ec3．2．l）。分泌菊粉酶的微生物在自然界中分布很廣，土壤、水和動物消化道中的多種微生物都能分泌。菊粉酶可以在一定的溫度條件下水解菊粉成果糖或低聚果糖。

菊粉酶有不同的分類方法。

根據菊粉酶在微生物體內主要分布于細胞內、細胞壁和細胞外，分別稱為胞內酶、胞壁結合酶和胞外酶，它們的比例主要受菌種、碳源、溫度和ph的影響（ettalibi等，1990）：l）隨著溫度的升高胞外酶比例下降，而其他兩種酶比例上升；2）以菊粉或蔗糖為碳源培養微生物時，前者胞外酶比例高于后者，其他兩種酶則相反；3）胞外酶主要由真菌合成，細胞壁結合酶主要產自酵母；4）適當的ph使細胞壁通透性增大，提高了胸外酶比例，其他兩種酶比例下降。

根據作用底物方式的不同，或者說根據菊粉酶酶切果聚糖鏈方式分為內切酶（ec3．2．1．7）和外切酶（ec3．2．1．80）。通常用i/s的大小來區分內切型菊粉酶和外切型菊粉酶，i是以菊粉作底物時的酶活，s是以蔗糖作底物時的酶活。一般認為外切菊粉酶的i/s值比內切菊粉酶的us低。內切菊粉酶水解菊粉可以得到高純度低聚果糖，常由真菌分離出來。外切菊粉酶在胞內、胞壁、胞外都有分布，它水解菊粉可以得到高純度果糖。

根據來源菊粉酶可以分為微生物菊粉酶和植物菊粉酶。

2．l熱穩定性絕大多數報道中，菊粉酶的最適溫度為52～64℃之間，55～58℃最適宜。

2．2ph值對活力的影響菊粉酶最適ph為弱酸性，這一性質不僅操作安全，而且使用過程中可以防止微生物污染，也是果糖最穩定的ph值。

2．3底物專一性李俊剛等（1999）認為，提高菊粉酶酶解效率的關鍵在于提高酶活和增加底物對酶作用的敏感性。據研究報道，菊粉酶不僅可以對菊粉作用，也可以對蔗糖及棉子糖作用，并表現出更高的活力和水解能力。使用菊芋提取液或菊粉做碳源，都能誘導產生菊粉酶，但菊芋提取液作底物效果更好。這可能是因為提取液除含菊粉外，還含有較多的短鏈的多聚果糖，更有利于菌體的生長以及被酶水解（pramod等，1991）。也就是說，一定的底物可以誘導生成菊粉酶，但用不同的碳源作底物對酶的活性影響很大。研究發現一定濃度的菊粉、麥芽糖和低濃度的果糖能夠誘導生成菊粉酶，淀粉對菊粉酶的影響不大，葡萄糖卻能明顯地抑制菊粉酶活性。表明菊粉酶有底物專一性。

菊粉酶的來源很廣，自然界中的植物以及土壤、水和動物消化道中的多種微生物都可以分泌菊粉酶。微生物來源的菊粉酶種類多，熱穩定性好，適于發酵生產。據不完全統計，產菊粉酶的有絲狀真菌17個屬物余種，酵母菌10個屬20余種，細菌12個屬10余種。目前有不少研究人員仍在致力于篩選新的產酶菌種，并對現有菌種進行改造，以得到高酶活、熱穩定性好的生產菌株。大多數微生物菊粉酶均為外切型菊粉酶，并且常常呈現出轉化酶活力，轉化酶是一種水解蔗糖為葡萄糖和果糖的酶，對葡粉沒有作用。

菊粉酶的純化步驟一般分為：（nh4）2so4沉淀、離子交換層析及凝膠過濾色譜等。離子交換層析可用來選擇性地分離外切型菊粉酶和內切型菊粉酶，通常用naci進行線性梯度洗脫，隨著na－ci濃度增加，內切菊粉酶先洗出，外切酶后洗出（azhall等，1989）。菊粉酶的提純過程：在0℃條件下，用40%飽和硫酸銨除雜蛋白，用90%飽和硫酸鉸析出菊粉酶，用sephadexg25脫鹽，聚乙二醇透析濃縮；再進行sophadexg200層析，操作溫度10℃；然后進行deae一纖維素de52離子交換層析；最后4℃、120v恒壓電泳分離（賈英民等，1998）。

常見的酵母和真菌中分離的酶多同時具有菊粉酶和轉化酶活性，為區分兩者，人們常采用“e＝菊粉酶總酶活+轉化酶總酶活”的公式，當e＞0．02為菊粉酶，e＜0．02則為轉化酶。菊粉酶酶活定義為在一定的反應條件下每分鐘釋放lμmol果糖所需酶量；轉化酶酶活定義為每分鐘水解1μmol蔗糖所需的酶量。由于目前測定菊粉酶酶活的定義沒有統一標準，因此酶活的單位也有不同。

6．l酶液的制備胞外菊粉酶粗酶液的制備：將發酵液過濾或離心即可得粗酶液。胞內菊粉酶粗酶液的制備：取一定量的發酵液離心后得菌體，將菌體用0．lmol/lph值為5．6的醋酸緩沖液洗滌2～3次后，加緩沖液至原體積，然后用超聲波處理（10khz，100w，5min）菌懸液，處理液即為胞內菊粉酶粗酶液（肖春玲，1999）。

6．2酶活測定黎明蘭等（1995）用菊芋提取液做培養基。發酵后取0．05ml發酵液加4．5ml5%菊粉液，55℃反應30min，沸水浴煮10min終止酶活，在同樣的反應系統和條件下加入沸水浴煮10min的酶作空白對照。取一定量反應液用費林試劑熱滴定法測糖（北京大學生物系生物生化教研室，1986）。酶活單位定義為：在上述反應條件下生成lμmol/min還原糖所需酶量為1個酶活單位。

uhm等（1987）報道的方法是，取50μl適當稀釋的酶液，加入450μl5%的菊粉（0．lmol、ph4．5的醋酸緩沖液配制），60℃保溫10min，沸水浴5min，滅活終止反應（在完全相同的條件下滅活酶底物作對照），快速冷卻后，用somogi-nelson法（derycke等，1984）測定還原糖。陳曉明等（2000）測定酶活時與uhm的方法不同的是，用3、5－二硝基水楊酸比色法測定還原糖數量，酶活單位定義為：在上述反應條件下，每分鐘催化菊糖水解生成lμmol還原糖的酶量。

7．l利用菊粉酶生產高果糖漿由于高果糖漿價格低廉，味甜，爽口，滲透壓高，保藏效果好，熱值低，不易造成齲齒，而且糖尿病患者可利用，所以在美、日等發達國家被廣泛用于食品和醫藥工業。20世紀70年代以后，各國開始關注以菊粉為原料，以酸法和酶法水解制備果糖。酸法雖然產量高，但副產物多，色素重，分離精制難。80年代，美國、法國人b利時、加拿大等國的研究人員開始研究利用菊粉酶制果糖，其工藝簡單，轉化率高，產物純，果糖產量高，可直接生產超高果葡糖漿（uhfgs），果糖含量90%以上。為此美國、英國、丹麥、法國、加拿大等發達國家都在進行研究。由此可見菊粉酶在果糖及果葡糖漿的生產上具有巨大的開發應用潛力。外切菊粉酶降解產物以果糖為主且果糖比例高。菊粉酶生產高果糖漿的研究國內外都較多，我國對其研究還處于起步狀態。

7．2利用菊粉酶生產低聚果糖低聚果糖是一種良好的雙歧因子和水溶性膳食纖維，有防治便秘、抑制腸內腐敗物質形成、提高機體免疫力、改善脂質代謝、降低膽固醇等作用，同時適于糖尿病人食用。比利時orafti公司投資20億比利時法郎，歷時數十年種植菊藝開發生產低聚果糖和菊粉，分別作為食糖和油脂代用品（胡學智，1997）。日本明治制果也在大規模生產。中國食品發酵研究所、上海醫藥工業研究所等已經試制成功，正在擴大試驗中。工業上生產利用菊粉酶生產低聚果糖的方法是由內切型菊粉酶水解菊粉而成，產物以低聚果糖為主，純度高，原料便宜，低聚果糖已被視為食品原料，而非食品添加劑。

7．3利用菊粉酶生產酒精利用菊粉酶生產酒精，國外相關研究較多。國外有報道指出，用aa-pergillusniger（schorr-garlindo等，1995）、k．fragilis（ohta等，1993）或k．margaritis（margantis等，1982）發酵菊粉生產酒精，aspergll。niger轉化率為明%以上（v/v），后兩者幾乎能完全將菊粉發酵成酒精。發酵粗菊芋提取液，不需加其他營養物質，25h內酒精產量87．8%。

7．4其他方面的應用菊粉酶還可直接發酵菊粉制備各種產品，如可制備丙酮丁醇，用于診斷腎臟疾病，控制血糖升高。另外，嚴奉偉等（1999）已經開始進行菊粉軟糖的試制。利用菊粉酶直接發酵菊粉，制作功能性食品和飼料添加劑將有巨大的生產開發潛力。

我國在菊粉酶的研究和應用中遇到的主要困難是：l）產酶成本高，導致應用成本高。主要表現在產酶菌株的菊粉酶產量低，提高了應用成本，制約了低聚果糖在食品工業和飼料工業中的應用。2）菊粉酶酶活測定及酶活力單位在定義上不統一，不利于研究者之間的交流和溝通。酶活力的測定方法對確定菊粉酶活力水平、特異性及歸類有重要意義。但目前在菊粉酶活力測定方法及酶活力單位定義上尚未統一。多數菊粉酶活力測定報道，是以不同聚合度、純度和濃度的菊粉或蔗糖做底物，測定反應混合物在一定時間內還原糖的增加量。另外，內切型菊粉酶的酶解產物多為低聚果糖和少量果糖，所以按現有的酶活測定法及酶活定義，其酶活水平將普遍比外切型菊粉酶低。因此測定和活力單位定義標準的統一是急需解決的問題。

韓冰

好好，有個同學正在做這方面的實驗。