綠色飼料添加劑抗菌肽的研究進展

nety 2007-7-1 18:34

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　　摘要:抗菌肽是哺乳動物防御體系的一個重要組成部分,具有分子量小,熱穩(wěn)定性好,無免疫原性,抗菌譜廣等特點。對畜禽具促生長、保健和治療疾病的功能，且無毒副作用、無殘留、無致細菌耐藥性。本文就抗菌肽的分類、抗菌機理、應用效果及作為飼料添加劑的應用優(yōu)勢等方面進行了綜述。
　　　　
　　關鍵詞:抗菌肽; 飼料添加劑;作用機理;應用效果　　
　　　　
　　隨著抗生素的大量廣泛用于飼料中和人們對食品和環(huán)境質(zhì)量的要求越來越高，人們對抗生素的副作用認識日益加深，抗生素在飼料業(yè)中的應用，已面臨著淘汰或禁用的局面。應用無毒無公害的新型抗菌劑代替抗生素作飼料添加劑，已成為當前國內(nèi)外飼料學科的一項重要內(nèi)容。隨著我國進入WTO，抗生素作飼料添加劑必將嚴重影響畜產(chǎn)品在國際市場的競爭力，應用生物技術研究與開發(fā)新型抗菌劑是我國飼料科學界一項緊迫的任務。
　　　　
　　抗菌肽具廣譜抗菌作用，對畜禽具促生長、保健和治療疾病的功能，屬無毒副作用、無殘留、無致細菌耐藥性的一類環(huán)保型制劑。可應用生物工程的技術方法生產(chǎn)抗病菌的轉(zhuǎn)基因動植物產(chǎn)品,同時可以通過基因工程的技術方法大量的表達抗菌肽,使之成為新一代肽類抗菌藥的來源，具有出廣闊的應用前景。
　　　　
　　1　抗菌肽的分類
　　　　
　　1 .1　哺乳動物抗菌肽哺乳動物抗菌肽廣泛存在于嗜中性白細胞、粘膜和皮膚等。例如,在豬腸中存在富含pro-arg,相對分子質(zhì)量為471 9ku的PR-39肽、Cecropin P1、有78個氨基酸殘基的NK-lysin、在豬白細胞中分離出 5個小分子抗菌肽,它們僅含16～18個氨基酸殘基;在綿羊中至少已發(fā)現(xiàn)10種抗菌肽基因;牛中至少已發(fā)現(xiàn)30種抗菌肽;另外,牛奶中也分離到3種抗菌肽,它們具有抑制腸毒性大腸桿菌,單核細胞增多性李氏桿菌的生長。
　　　　
　　防御素是哺乳動物中研究最多的抗菌肽,包括兩大類:α-防御素和β-防御素。主要存在于哺乳動物的白細胞、吞噬細胞或小腸的潘氏細胞中,特別是在嗜中性白細胞中。防御素通常由2 7～54個氨基酸殘基組成,通過保守半胱氨酸構成3個穩(wěn)定的鏈內(nèi)二硫鍵使肽環(huán)合形成穩(wěn)定的反向平行的β片狀結(jié)構。哺乳動物防御素具有保守的6個半胱氨酸, 能形成3個穩(wěn)定的鏈內(nèi)二硫鍵,這也是區(qū)別其他抗菌肽的主要特征之一。防御素抗微生物譜比較廣泛,包括革蘭氏陽性菌和陰性菌、分枝桿菌、螺旋體、真菌和一些被膜病毒,此外,對惡性細胞也具有毒殺作用。
　　　　
　　1.2昆蟲抗菌肽從天蠶的免疫血淋巴中分離得到的高效抗菌肽Cecropins是最早發(fā)現(xiàn)的抗菌肽。此后在許多昆蟲中也鑒定出有Cecropins或類似分子。Lee等在豬的腸中也發(fā)現(xiàn)了一個Cecropin,這可能暗示Cecropins廣泛存在于動物中。
　　　　
　　Cecropins 對各種大腸桿菌和其他革蘭氏陰性細菌,如沙門氏菌,具有很強活性,且對某些革蘭氏陽性菌也具有殺傷活性,但對霉菌和其他真核細菌無細胞毒性作用。 Cecropins為一線性陽離子肽家庭,鏈長35～40個氨基酸殘基,而Ｃ-末端最后一個殘基的羧基酰胺化。Cecropins的ｃDNA序列分析顯示其前體分子含62～64個氨基酸殘基,而Ｃ-末端最后一個殘基的羧基酰胺化。Cecropins的ｃDNA序列分析顯示其前體分子含62～64個氨基酸殘基,具有保守的信號序列和前導序列。該基因在蠶中有3個;果蠅中有4個。損傷和感染時誘導該基因表達。如注射細菌碎片或LPS后幾小時內(nèi)昆蟲脂肪細胞中特異性ｍRNA大量增加,24ｈ內(nèi)即可在血淋巴液中檢測出Cecropins。天然免疫細胞膜受體識別微生物成分后,通過Toll通路而激活NF-KB樣子。
　　　　
　　蜂毒溶血肽是蜜蜂毒液中的一種多肽,由26個氨基酸殘基組成,其分子量為2480Ｄ。蜂毒溶血肽可直接與紅細胞的膜脂作用具有較強的溶血作用。Apila是從蜜蜂體液中提取的一種短肽,由18個氨基酸組成,具有高效廣譜的抗菌作用而對真核細胞無毒性。
　　　　
　　1.3 蛙類抗菌肽 Zaslff在非洲爪蟾皮膚中發(fā)現(xiàn)了小分子抗菌肽,稱為Magainins。此后相繼發(fā)現(xiàn)了多種蛙類抗菌肽,如在非洲爪蟾中就有十多種抗菌肽,不僅在皮膚顆粒腺表達,也有存在于胃粘膜和小腸道細胞。蛙類抗菌肽具有協(xié)同效應,但不同的蛙類抗菌肽很少具有同源性。
　　　　
　　1.4植物抗菌肽 Thionins是最早從植物中分離的抗菌肽。它們對革蘭氏陽性菌、陰性菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞均有毒性。其他一些結(jié)構上與昆蟲、哺乳動物防御素結(jié)構相似的植物抗菌肽,稱為植物防御素。
　　　　
　　1.5細菌抗菌肽細菌抗菌肽包括陽離子肽和中性肽,革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有分泌。例如乳酸鏈球菌肽是由乳球菌產(chǎn)生的含3～4個氨基酸殘基的短肽,它是一種耐酸性物質(zhì),即使在胃這樣低ｐＨ環(huán)境中穩(wěn)定性也很高,能抑制革蘭氏陽性菌如梭狀芽孢桿菌和李氏桿菌。
　　　　
　　2 抗菌肽的抗菌機理抗菌肽具有廣譜殺菌作用,抗菌作用主要是由于在兩親性的α螺旋結(jié)構作用下,使原核細胞質(zhì)膜上形成離子通道,這種通道的直徑經(jīng)推算大約為 4nm,離子通道的形成改變了細胞內(nèi)外的滲透壓,使細胞內(nèi)物質(zhì)大量外滲,起到殺菌作用。姜明等通過電鏡觀察了柞蠶抗菌肽對大腸桿菌的作用,發(fā)現(xiàn)經(jīng)一定時間的作用后,在細菌外壁形成了喇叭狀缺口,這說明抗菌肽分子是以一端插入細菌細胞膜,通過“打孔”形成一個通道,使細菌細胞膜破裂,原生質(zhì)“泄漏”而死亡。從這點看,抗菌肽的正電荷與細菌胞膜的磷脂頭負電荷間的作用至關重要,在肽分子中N端α螺旋的雙親性是裂解細菌的主要部分,C末端的酰胺化與廣譜抗菌有關。從而可看出抗菌肽的抗菌機理與通過阻斷大分子的生物合成來發(fā)揮作用的抗菌素的抗菌機理完全不同,且病原菌不易對其產(chǎn)生耐藥性,因此該物質(zhì)將成為新抗菌藥的來源.。
　　　　
　　3 抗菌肽的應用研究
　　　　
　　3.1在畜牧業(yè)上的應用仔豬腹瀉、奶牛乳房炎及各種病毒性疾病如豬瘟、雞新城疫等一直是棘手的疾病,不利于畜牧業(yè)的發(fā)展。借鑒已成功的昆蟲抗菌肽轉(zhuǎn)基因工程,如轉(zhuǎn)基因蚊子、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、轉(zhuǎn)基因水稻等,把特異的抗菌肽基因轉(zhuǎn)入畜禽特定細胞讓其表達,從而產(chǎn)生抗病新品種。據(jù)美國學者報道，抗菌肽可以作為飼料防霉劑。另有報道，柞蠶抗菌肽應用于預防及治療雞的白痢效果明顯。應用含抗菌肽的柞蠶免疫血淋巴粉添加于斷奶仔豬料，飼喂試驗結(jié)果表明，蠶抗菌肽可減輕斷奶仔豬的腹瀉。
　　　　
　　溫劉發(fā)等(2001)報道,通過50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)中間試驗，在優(yōu)化發(fā)酵條件后，用甲醇誘導啟動醇氧化酶啟動子而成功表達抗菌肽基因并分泌抗菌肽到菌體外，培養(yǎng)液中抗菌肽的殺菌活力達5000 單位／ml。進一步改進培養(yǎng)基配方，掌握較適宜的培養(yǎng)條件，包括PH、溫度、供氣量及攪拌速度等，發(fā)酵生產(chǎn)周期可縮短到24h，殺菌活力達5600單位／ml。以這些工程酵母發(fā)酵液作試驗，通過飲水攝入劑量為60u／只?d的粵黃雞飼養(yǎng)試驗結(jié)果表明，抗菌肽可促進小雞生長和減少排泄物氮含量,對粵黃雞具有促生長、保健和治療疾病的功能。蠶抗菌肽酵母制劑作飼料添加劑的應用效果顯著。
　　　　
　　3.2藥用隨著傳統(tǒng)抗生素的廣泛及長期的應用,許多病源菌對它們產(chǎn)生了耐藥性,而具有廣譜抗菌且有獨特的抗菌機制的抗菌肽顯然在這方面的應用研究中具明顯優(yōu)勢。隨著對抗菌肽結(jié)構與活性的關系、抗菌肽作用機制及其基因表達調(diào)控機制認識的不斷深化,一種高效的、有利于人類健康的抗菌肽作抗生素替代品成為現(xiàn)實。蠶抗菌肽在醫(yī)學上已被開發(fā)利用，如已用于治療腎炎的“腎肝寧”及批準作西藥Ⅱ類進行臨床觀察的乙型肝炎新藥，而以抗菌肽作為消洗劑、治療胃十二指腸潰瘍及消化道炎癥的新藥正在進行。蛙皮膚上有許多腺體，能產(chǎn)生許多種類的生物活性肽，其中Magainin抗菌肽已經(jīng)基因工程的方法合成Magainin (馬蓋寧)新藥。
　　　　
　　3.3蠶抗菌肽的基因工程研究抗菌肽具廣譜抗菌活性，但在正常動物體中含量少，給其應用帶來了困難。至今研制和應用的抗菌肽，均是從免疫蠶蛹中提取的，而柞蠶蛹免疫血清中抗菌肽的含量很低，提取價格昂貴。為能降低抗菌肽的生產(chǎn)成本，進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，已人工設計合成抗菌肽D、BD及AD基因，并成功將其導入釀酒酵母及畢赤酵母中進行表達。
　　　　
　　4抗菌肽作飼料添加劑應用的優(yōu)勢
　　　　
　　抗菌肽能耐受飼料制粒時的高溫。規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽時經(jīng)高溫濃縮工序，可充分殺滅酵母菌體而不導致抗菌肽失活，產(chǎn)品在推廣應用后不會出現(xiàn)工程菌的擴散而導致環(huán)境生態(tài)問題。抗菌肽殺菌機理獨特，病原菌不易對抗菌肽產(chǎn)生耐藥性，以工程菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽，可大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低且不受季節(jié)和氣候變化等外在環(huán)境的影響。再者，抗菌肽產(chǎn)品具廣譜抗菌作用，對畜禽具促生長、保健和治療疾病的功能，屬無毒副作用、無殘留、無致細菌耐藥性的一類環(huán)保型制劑。
　　　　
　　總之，抗菌肽有著獨特的不同于抗生素的抗菌機理,它廣泛存在于多種生物體內(nèi),是生物體對外界病原物侵染而產(chǎn)生的一系列免疫反應的產(chǎn)物，具有較強的廣譜抗菌能力。尋找各種動物內(nèi)源性抗菌物質(zhì)，以現(xiàn)代生物技術方法工業(yè)化生產(chǎn)這些在抗病原菌上具有動物“種”專一性或特異性的系列產(chǎn)品，必將成為替代抗生素的新型飼料添加劑。