枯草芽孢桿菌發酵產物有效磷變化及常規營養成分的評定

　

　　我國是產棉大國，年產棉籽800余萬噸，榨油后可以生產出棉籽餅粕約400萬噸。新疆作為我國最大的棉花生產基地，其棉花產量約占全國產量的1/3。棉籽餅粕是棉花加工業的主要副產品，富含蛋白質（30%～45%），是重要的蛋白飼料資源，2007年新疆總產量高達140多萬噸。棉籽餅粕中不僅含有大量的游離棉酚和環丙烯脂肪酸，還含有植酸等抗營養因子，限制了棉粕在飼料生產中的廣泛應用。

　　植酸鹽是棉籽餅粕飼料的抗營養因子，其含量約占棉粕干物質的0.84%，植酸的存在會對棉籽餅粕作為飼料的生物學效價產生一定的影響力。植酸會對動物在自身所必需的礦物質吸收利用上產生一系列的阻礙作用，例如引發動物厭食、消瘦和生長緩慢等病癥；棉籽中的植酸減少了有效磷的利用率；植酸還會影響動物對蛋白質的消化利用。飼料中添加植酸酶對提高畜禽業生產效益及降低植酸磷對環境的污染有重要意義。

　　枯草芽孢桿菌是我國農業部公告（第1126號）公布的直接飼喂動物的一種微生態有益菌種，在其生長繁殖過程中可產生植酸酶；玉米是重要的糧食作物和飼料來源，也是全世界總產量最高的糧食作物。研究以產植酸酶枯草芽孢桿菌為菌種，以玉米和棉粕組成的棉粕源生物發酵飼料進行發酵，探究其對棉粕源發酵飼料中有效磷及常規營養成分的影響，為開發棉粕源枯草芽孢桿菌發酵飼料，微生態發酵飼料的科學評定和合理利用提供理論依據；為促進動物生長、生物發酵飼料的科學利用、提高飼料的利用率等提供理論支撐。

　　1　材料與方法

　　棉粕、玉米粉均由新疆石河子天康飼料有限公司提供，粉碎，過60目篩。

　　1.2　菌種及培養基

　　1.2.1　菌種

　　產植酸酶枯草芽孢桿菌Z3由新疆石河子大學動物營養實驗室選育。

　　1.2.2　營養瓊脂培養基

　　蛋白胨10gL-1、牛肉膏3gL-1、NaCl5gL-1、瓊脂15gL-1。pH7.0，121℃條件下高壓15min。以下培養基均做同樣處理。用于菌株純化、平板計數。

　　1.2.3　植酸酶液體培養基

　　取經過60目篩粉碎過的麩皮100g加到900mL水中，121℃處理60min，8層紗布過濾，濾液定容至1L，加入胰蛋白胨10g、（NH4）2SO40.4g、MgSO47H2O0.2g、KH2PO40.05g、K2HPO40.04g、CaCl22g，pH7.0。

　　1.3　種子液培養

　　將枯草芽孢桿菌Z3接入營養瓊脂培養基，37℃培養24h，挑取1環菌苔接入20mL（50mL三角瓶）植酸酶液體培養基，37℃、200rpm搖動培養15h（一級菌種），取一級菌種1mL接入（150mL三角瓶）WBE培養基50mL，37℃、200rpm搖動培養15h（二級菌種）。

　　1.4　主要儀器和試劑

　　高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3750，日本）；電熱恒溫鼓風干燥箱（GZX-9246MBE，上海）；電熱恒溫水浴鍋（DKB-501A，上海）；722型可見光分光光度計；離心機（日立HITACHI），隔水式恒溫培養箱，HH型電熱恒溫水浴鍋。Folin酚試劑、碳酸鈉溶液0.4mol、三氯乙酸（TCA）溶液0.4mol、pH7.2磷酸鹽緩沖液、酪蛋白2%溶液、酪氨酸溶液100gmL-1，均按SB/T1031721999配制。

　　1.5　試驗方法

　　1.5.1　底物發酵處理方法

　　試驗組底物處理：將棉粕90g、玉米粉10g加入500mL三角瓶中混合均勻，然后加入蒸餾水30mL，充分攪拌，在0.056MPa、121℃條件下蒸汽滅菌20min，冷卻后于無菌條件下接入產植酸酶枯草芽孢桿菌Z3二級種子液7mL，攪拌均勻，三角瓶四層紗布封口，于恒溫培養箱37℃靜止培養72h。發酵結束后，將發酵產物放入烘箱中45℃烘干48h，冷卻粉碎，過60目篩，裝入樣品袋，保存于4℃冰箱中待測。

　　對照組發酵底物處理：將試驗底物加入500mL三角瓶中混合均勻，然后加入蒸餾水30mL，充分攪拌調濕，pH自然，在0.056MPa、121℃條件下蒸汽滅菌20min，冷卻后接入液體培養基（不含菌種）7mL，攪拌均勻，不經發酵，直接將其放入烘箱中，45℃烘干48h，冷卻粉碎，過60目篩，裝入樣品袋，保存于4℃冰箱中待測。

　　常規營養指標的測定參考楊勝《飼料分析及飼料質量檢測技術》。植酸酶活性的測定方法參照GBT：18634-2009進行，并做了適當修改，酶液用pH5.5的乙酸鈉緩沖液稀釋至103，取1mL于37℃預熱5min，加入5mmolL-1植酸鈉溶液2mL，37℃反應30min，加入顏色終止液2mL，室溫條件下靜置10min后，取上清液3mL于415nm處測定OD值。空白對照是將酶液和終止液37℃溫浴30min后再加入底物植酸鈉。植酸酶活性單位定義為樣品在植酸鈉濃度為5mmolL-1、溫度37℃、pH5.5的條件下，植酸鈉中釋放1μmolmin-1無機磷為1個植酸酶活性單位（U）。植酸含量的測定參照《三氯化鐵比色法測定植酸含量的研究》進行測定。植酸磷含量的測定參照《植物飼料中植酸磷的含量及測定》。蛋白酶活性的測定方法為福林法，參照中華人民共和國專業標準SB/T10317-1999。液化型淀粉酶的活力單位定義為1h內能液化1g淀粉為1g液化型淀粉的酶量，參照馮莉方法。底物中枯草芽孢桿菌含量的測定采用平板計數法。

　　試驗數據采用Excel軟件，使用SPSS16.0統計軟件的One-wayANOVA對數據進行方差分析，選取LSD法進行組間差異的顯著性檢驗，結果以“平均值±標準誤”表示。

　　2　結果與分析

　　2.1　發酵前后底物中植酸含量及枯草芽孢桿菌數量的變化

　　發酵前后底物中植酸含量及枯草芽孢桿菌菌數的變化見表1。

　　從表1中可以得出，發酵前后植酸及植酸酶含量變化規律為發酵后植酸含量極顯著降低了6.84%（P<0.01）。說明產植酸酶枯草芽孢桿菌可以降低發酵棉粕中植酸的含量，但降解量很少，這與植酸酶活性較低有關。飼料中枯草芽孢桿菌數量極顯著增加7.98×107cfug-1（p<0.01）。< p="">

　　表1　發酵前后底物中植酸含量及枯草芽孢桿菌菌數的變化

　　

　　注：同列數據肩標相同字母者表示差異不顯著（P>0.05），肩標不同小寫字母者表示差異顯著（P<0.05），肩標不同大寫字母者表示差異極顯著（p<0.01）。下表同。< p="">

　　2.2　發酵前后底物中常規營養成分的變化

　　發酵前后底物中常規營養成分的變化見表2。

　　

　　從表2可以看出，發酵后干物質（DM）提高了1.72%（P>0.05），粗蛋白質（CP）顯著提高了13.7（P<0.05），粗脂肪（ee）顯著提高了2.95（p<0.05），鈣（ca）極顯著提高了16%（p<0.01），磷（p）極顯著提高了31.8%（p<0.01），粗灰分（ash）含量極顯著降低了4.30%（p<0.01）。結果表明，枯草芽孢桿菌可顯著提高棉粕源飼料中p含量，這與植酸磷的磷被不同程度釋放出來，進而提高了飼料中磷含量有關。研究發現發酵后棉粕源生物蛋白飼料的營養價值都有不同程度提高。< p="">

　　2.3　發酵前后底物中總磷、植酸磷及有效磷的變化

　　發酵前后底物中總磷、植酸磷及有效磷的變化見表3。

　　由表3可知，發酵后底物中總磷極顯著的提高（P<0.01），植酸磷含量顯著降低6.4%（P<0.05），有效磷含量極顯著提高45.5%（P<0.01），植酸磷/總磷顯著降低13.2%（P<0.05），表明枯草芽孢桿菌發酵所產生的植酸酶可以有效的降解棉粕源飼料中的抗營養因子植酸及其鹽類（植酸磷），提高棉粕源飼料中有效磷的含量。< p="">

　　表3　發酵前后底物中總磷、植酸磷及有效磷的變化

　　

　　2.4　發酵前后底物中酶活性的變化

　　發酵產物中植酸酶活性提高103.72Ug-1，淀粉酶提高24.43Ug-1，蛋白酶活性提高23.21Ug-1，差異均極顯著（P<0.01）。< p="">

　　3　討論

　　利用微生物發酵法發酵棉粕源飼料，不但可以除去棉粕中的植酸，而且還可以提高棉粕飼料的營養價值，改善棉粕源飼料蛋白質品質，同時可以產生多種消化酶及提高發酵產物的菌群數量，對提高棉粕源飼料的綜合利用價值具有重要意義。

　　3.1　微生物發酵棉粕源飼料后常規營養成分的變化

　　微生物在發酵中大量繁殖，可將底物中非蛋白氮、無機氮、碳及抗營養子等轉化為營養價值高的菌體蛋白。張慶華等用熱帶假絲酵母菌CA61、擬內孢霉菌E02和植物乳桿菌3種菌株混合固態發酵棉粕后，粗蛋白質含量從30.05%提高到34.50%，棉粕外觀蓬松變軟，氣味芳香。吳偉偉等研究黑曲霉與釀酒酵母混合固態發酵棉籽餅粕，真蛋白質含量從32.99%提高到42.40%。肖永友等用經馴化后的酵母菌Y-619對發酵棉粕源飼料，發酵后真蛋白質含量提高3.10%。院江等利用由乳酸菌與酵母菌等主要有益菌組成的復合菌發酵棉籽殼，CP提高2.29%，中性洗滌纖維（NDF）降低18.21%，酸性洗滌纖維（ADF）降低16.04%，棉籽殼營養價值顯著提高。張文舉等研究表明，利用熱帶假絲酵母菌ZD-3、黑曲霉菌ZD-8對棉籽餅進行復合固體發酵，棉籽餅底物粗蛋白質提高27.83%，粗纖維含量有所降低，其中假絲酵母菌株發酵棉籽餅，可顯著降低底物中的EE含量（P<0.05）。< p="">

　　本試驗以枯草芽孢桿菌發酵棉粕源生物飼料，CP提高13.7%，主要原因是微生物生長繁殖過程中消耗底物而導致發酵物的絕對含量減少和微生物利用非蛋白氮合成菌體蛋白，從而提高發酵產物中粗蛋白質含量。棉籽餅底物經枯草芽孢桿菌發酵后，其EE含量提高2.95%，說明在發酵過程中枯草芽孢桿菌合成一定量的EE。

　　3.2　微生物發酵棉粕源飼料后酶類、益生菌等含量的變化

　　枯草芽孢桿菌株在其生長繁殖過程中能夠產生淀粉酶、植酸酶、纖維素酶和少量脂肪酶等酶類。金紅春研究證實，棉粕經過發酵后，淀粉酶活力提高766Ug-1、纖維素酶活力提高494Ug-1、脂肪酶活力提高249Ug-1。徐晶研究發現，發酵后棉粕中蛋白酶含量為664.17Ug-1，淀粉酶為471.73Ug-1，酵母菌為2×106cfug-1，芽孢桿菌為1.3×108cfug-1。邱良偉研究發現，發酵棉粕中芽抱桿菌和酵母菌總活菌數可達4.6×108cfug-1。夏新成等研究了2株酵母和1株霉菌復合固態發酵對棉籽粕脫毒效果及營養價值的影響，結果表明，蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶活力變化顯著（P<0.05）。王小磊利用復合菌種對棉粕源飼料進行發酵，發酵后酵母菌活菌數達2.2億g-1（干基），乳酸菌活菌數達2.3億g-1（干基），芽孢桿菌達18.4億g-1（干基）。本試驗以枯草芽孢桿菌發酵棉粕源生物飼料，發酵結束后枯草芽孢桿菌菌數提高7.98×107cfug-1，發酵產物中植酸酶、淀粉酶、蛋白酶分別提高103.721ug-1、24.431ug-1、23.21ug-1，差異均極顯著（p<0.01）。< p="">

　　3.3　微生物發酵棉粕源飼料后有機磷含量的變化

　　關于利用植酸酶降解棉粕或棉粕源飼料中植酸的報道較少。劉曉俠等利用植酸酶對棉粕進行處理，研究在不同濃度的植酸酶作用下，棉粕中有機磷的轉化情況，研究發現，植酸酶能顯著降低棉粕中的有機磷含量（P<0.05），提高無機磷的含量，且在1000Ukg-1時植酸酶最為經濟有效。曹玲等利用微生物植酸酶分別對3種植物性原料（豆粕、玉米蛋白粉、小麥）進行酶處理，結果表明，植酸酶能夠顯著降低3種植物性原料中植酸磷的含量（P<0.05），同時提升有效磷的含量，通過對磷當量的分析，以植酸酶組1000Ukg-1最為經濟有效。本試驗以枯草芽孢桿菌發酵棉粕源飼料，發酵后底物中總磷極顯著的提高（P<0.01），植酸磷含量顯著降低（P<0.05），有效磷含量極顯著的提高（P<0.01），植酸磷/總磷顯著降低（P<0.05），表明枯草芽孢桿菌發酵所產生的植酸酶可以有效的降解棉粕源飼料中的抗營養因子植酸及其鹽類（植酸磷）。< p="">

　　產植酸酶枯草芽孢桿菌對棉粕源生物飼料進行發酵，發酵后CP、EE、Ca、P的含量均有所提高，Ash、NDF的含量略有所降低，棉粕源生物蛋白飼料的營養價值都有不同程度的提高；發酵后植酸含量降低，總磷含量及有效磷含量提高，但提高量很少，這與植酸酶活性較低有關；蛋白酶活性較低，這可能與菌株誘變有關。

　　產植酸酶枯草芽孢桿菌對棉粕源生物飼料進行發酵，發酵后CP、EE、Ca、P的含量均有所提高，Ash含量略有所降低，棉粕源生物蛋白飼料的營養價值都有不同程度的提高；發酵后植酸含量降低，總磷含量及有效磷含量提高，但提高量很少，這與植酸酶活性較低有關；蛋白酶活性較低，這可能與菌株誘變有關。

　　4　結論

　　利用產植酸酶枯草芽孢桿菌對棉粕源生物飼料進行發酵，可有效提高飼料的營養價值，降低底物植酸含量，從而對提高飼料蛋白質及礦物質等營養的利用率、降低植酸磷對環境污染，具有一定的生產意義。