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畜牧人

標題: 芽孢桿菌菌體形態觀察生理生化試驗 [打印本頁]

作者: kiroco 時間: 2014-3-20 08:36
標題: 芽孢桿菌菌體形態觀察生理生化試驗
將COL-J菌接種到初篩平板上37℃培養24h，觀察菌落形態；接種于種子培養基中37℃，180r/m搖瓶培養12h，做革蘭氏染色觀察。
1 生理生化試驗：以一株標準短小芽孢桿菌為對照，對COL-J菌的部分生理生化特征進行實驗觀察。
根據分離菌的菌落和菌體形態，芽孢的有無和著生情況，以及生理生化反應，按東秀珠《常見細菌系統鑒定手冊》進行初步分類[8] 。
2 16S rDNA的PCR擴增
生物細胞DNA分子的一級結構中既具有保守的片段，又具有變化的堿基序列,保守的片段反映了生物物種間的親緣關系，而高變片段則能表明物種間的差異．這些核苷酸序列則是不同分類級別生物(如科、屬、種)鑒定的分子基礎，以16SrDNA為聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的靶分子進行細菌快速分類鑒定，與其它細菌鑒定方法比較，具有高效、準確、簡便、特異性強的優點[9]。
1.4.3.1細菌總DNA的提取
將菌種接種于20mL/150mL種子培養基，37℃ 180r/m培養12 h，按如下柱式DNA out抽提試劑盒使用手冊提取菌株COL-J的總DNA：
(1)取1mL菌液離心1 min后，重懸于0.6mL溶菌液中，吹打均勻，37℃保溫30 min。
(2)13000g離心10 min后棄上清夜。
(3)加入300uL溶液A到細菌沉淀中，吹打均勻。
(4)加入150uL溶液B到離心管中，顛倒數次混勻后溶液中將有白色絲狀懸浮物產生。
(5)65‍℃水浴放置3-5min。
(6)加入200uL氯仿，震蕩混勻30秒，溶液呈乳白色。
(7)13000g室溫離心2min，上清透明，中間層有白膜，小心轉移上清到新的離心管中，避免觸及中間的白膜。
(8)加入1.5倍體積（約0.6mL）的通用上柱夜到上清中，顛倒混勻全部轉移到離心吸附柱中，室溫放置4min。
(9)13000g室溫離心1min，DNA吸附在離心吸附柱的膜上，倒棄收集管中的穿透液。
(10)將0.5mL通用洗柱液加入離心柱中，13000g室溫離心1min，棄穿透液。
(11)重復第10步操作一次。
(12)空甩半分鐘，將離心吸附柱轉移到新的離心管中。
(13)加50-100uL自備TE（pH8.0），室溫放置3-5min。
(14)13000g室溫離心1min即得DNA溶液。
1.4.3.2 16S rDNA 的PCR擴增和序列測定
上游引物序列：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
下游引物序列：5’-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT-3’
PCR反應體系（25uL）為：10×buffer2.5uL, 25umol 的MgCl2 0.5uL，2.5mmol dNTP0.5uL，上游引物1uL,下游引物1uL, DNA0.5uL，5U/uL的Taq酶0.5uL，超純水17.5uL。PCR擴增程序為：95℃預變性5min；95℃45sec，56℃30sec，72℃1.5min，循環30次；72℃延伸10min。PCR產物送上海英駿 (invitrogen)生物技術有限公司進行序列測定。
1.4.3.3 序列比對
將16S rDNA測序結果在GenBank的核酸數據中進行同源性比對。

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