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畜牧人

摘要：本試驗選用六和預(yù)混料樣品，添加定量的KDN自產(chǎn)全細胞酶或植酸酶，利用DNS法檢測比較不同方法測得的酶活。結(jié)果表明，在稀釋酶緩沖液中添加6%的DETA·2Na可以明顯提高預(yù)混料中木聚糖酶或植酸酶的酶活測定值，采用一次性稀釋到位酶樣品比分級稀釋測得的木聚糖酶或植酸酶的酶活值明顯提高。

關(guān)鍵詞：預(yù)混料 木聚糖酶酶活 植酸酶酶活

飼用酶制劑的應(yīng)用效果現(xiàn)已毋庸置疑，它既能提高飼料的消化率和利用率，提高畜禽生產(chǎn)性能，又能減少畜禽排泄物中的氮、磷的排泄量，保護水體和土壤免受污染，因而飼用酶制劑作為一類高效、無毒副作用和環(huán)保型的“綠色”飼料添加劑，在21世紀將有著十分廣泛的應(yīng)用前景。然而酶制劑在飼料中的應(yīng)用還面臨一些問題，其中對于飼料、預(yù)混料中的酶活測定方法還不成熟，有些酶由于添加劑量小及飼料中各種干擾因子如重金屬離子等影響，實驗室測定非常困難，酶活測定結(jié)果變異較大。本試驗在預(yù)混料中添加以木聚糖酶為主的全細胞復(fù)合酶或植酸酶，通過不同方法分別測定預(yù)混料中的木聚糖酶酶活和植酸酶酶活，目的是探討比較預(yù)混料中酶活測定優(yōu)化條件，從而為預(yù)混料中酶活檢測方法提供新思路，為建立一種相對統(tǒng)一的檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試酶制劑

木聚糖酶：由康地恩集團以黑曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)的以木聚糖酶為主的全細胞復(fù)合酶;

植酸酶：由康地恩集團生產(chǎn)的顆粒植酸酶制劑5000u/g。

1.2 預(yù)混料：由山東六和青島和美飼料有限公司提供。分別為青島和美 LC633P蛋雞5%、LC15蛋雞5%、BC15肉小雞5%、BC35肉大雞5%、SB345豬4%、SB44P豬4%、LH660豬4%、EV24雞4%、BV15肉雞0.4%、DV14鴨0.4%、BV24肉雞0.4%。

1.3 木聚糖酶酶活定義

山東六和農(nóng)牧科技園企業(yè)標準Q/SLH002-2006：酶樣品于40℃，pH5.0條件下，1min水解木聚糖生成相當(dāng)于1μg木糖還原物質(zhì)，即為1個酶活力單位。

1.4 植酸酶酶活定義

國標GB/T6682-1992：樣品在植酸鈉濃度為5.0 mmol/L、溫度37℃、pH值5.5的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1μmol無機磷，即為一個植酸酶活性單位。

1.5試驗設(shè)計

1.5.1試驗設(shè)計分兩部分，一部分選擇預(yù)混料添加KDN全細胞酶采用不同優(yōu)化辦法進行木聚糖酶酶活比較，另一部分選擇預(yù)混料添加植酸酶采用不同優(yōu)化辦法進行植酸酶酶活比較。試驗設(shè)常規(guī)對照，即直接測定酶制劑樣品的木聚糖酶酶活或植酸酶酶活，作為100%絕對酶活與在預(yù)混料中測定酶活進行比較。

簡要試驗方案如下：

常規(guī)(對照組)：1g酶→溶解定容至100ml(稀釋緩沖液)容量瓶……;

試驗組：0.1g酶+5g預(yù)混料混勻(LC633P、LC15、BC15、BC35)→溶解定容……;

試驗組：0.1g酶+4g預(yù)混料混勻(SB34、SB44P、LH600、EV24)→溶解定容……;

試驗組：0.1g酶+0.4g預(yù)混料混勻(BV14、DV鴨、BV肉雞)→溶解定容……。

2.結(jié)果與分析

2.1各種預(yù)混料中添加KDN全細胞酶后木聚糖酶酶活測定結(jié)果(見表1)

表1 各種預(yù)混料中添加KDN全細胞酶后測定木聚糖酶酶活

樣品木聚糖酶酶活u/g%

KDN全細胞酶+LC633P蛋雞5%61049379.4

KDN全細胞酶+LC15蛋雞5%65556185.3

KDN全細胞酶+BC15肉小雞5%67256887.5

KDN全細胞酶+BC35肉大雞5%66491486.5

KDN全細胞酶+SB34豬4%68957489.7

KDN全細胞酶+SB44P豬4%73889496.1

KDN全細胞酶+LH600豬4%72869094.8

KDN全細胞酶+EV24雞4%76610599.7

KDN全細胞酶+BV14肉雞0.4%73719395.9

KDN全細胞酶+DV鴨0.4%66661586.7

KDN全細胞酶+BV肉雞0.4%68277288.8

KDN全細胞酶768656100

由表1測定酶活結(jié)果可知，大多數(shù)預(yù)混料中木聚糖酶活實際測定值都集中在655561～766105u/g之間，實際測定酶活表明仍有0.3～15%的酶活沒有測定出來。

2.2 LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加KDN全細胞酶酶稀釋緩沖液中是否添加EDTA·2Na對木聚糖酶酶活的測定比較(見表2)

表2 LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加KDN全細胞酶木聚糖酶酶活測定結(jié)果

樣品酶活u/g%是否添加EDTA·2Na

KDN全細胞酶+LC633P蛋雞5%57028385.12是

KDN全細胞酶+LC633P蛋雞5%55778383.84否

KDN全細胞酶665283100否

由表2可知，預(yù)混料LC633P蛋雞5%添加KDN全細胞酶，在測定過程中添加6%的EDTA·2Na，使得測定的木聚糖酶活提高了12500u/g，即提高了1.3%。

2.3LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加全細胞酶是否一次性稀釋到位測定木聚糖酶酶活比較(見表3)

表3 LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加KDN全細胞酶木聚糖酶酶活測定結(jié)果

樣品酶活u/g%是否一次性稀釋

KDN全細胞酶+LC633P蛋雞5%60611691.11是

KDN全細胞酶+LC633P蛋雞5%55778383.84否

KDN全細胞酶665283100否

由表3可知，預(yù)混料LC633P蛋雞5%添加KDN全細胞酶，在測定過程中一次性稀釋到位測定，使得測定的木聚糖酶酶活提高了48333u/g，即提高了7.27%。

2.4各種預(yù)混料中添加植酸酶后植酸酶酶活測定結(jié)果(見表4)

表4 各種預(yù)混料中添加植酸酶后測定植酸酶酶活

樣品植酸酶酶活u/g%

植酸酶+LC633P蛋雞5%393365.17

植酸酶+LC15蛋雞5%538789.26

植酸酶+BC15肉小雞5%549991.11

植酸酶+BC35肉大雞5%581396.3

植酸酶+SB34豬4%468177.56

植酸酶+SB44P豬4%558092.46

植酸酶+LH600豬4%582096.43

植酸酶+EV24雞4%591197.94

植酸酶+BV14肉雞0.4%564693.55

植酸酶+DV鴨0.4%571594.7

植酸酶+BV肉雞0.4%558392.51

植酸酶5000u/g6035100

由表4測定酶活結(jié)果可知，大多數(shù)預(yù)混料中植酸酶活實際測定值都集中在4681～5911u/g之間，實際測定酶活表明仍有2.06～22.44%的酶活沒有測定出來。

2.5在LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加植酸酶酶稀釋緩沖液中是否添加EDTA·2Na對植酸酶酶活的測定比較(見表5)

表5 LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加植酸酶后植酸酶酶活測定結(jié)果

樣品酶活u/g%是否添加EDTA·2Na

植酸酶+LC633P蛋雞5%516293.06是

植酸酶+LC633P蛋雞5%426176.8否

植酸酶5000u/g5548100否

由表5可知，預(yù)混料LC633P蛋雞5%添加植酸酶，在測定過程中添加6%的EDTA·2Na，使得測定的植酸酶酶活提高了901u/g，即提高了16.26%。

2.6在LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加植酸酶是否一次性稀釋測定植酸酶酶活比較(見表6)

表6 LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加植酸酶后植酸酶酶活測定結(jié)果

樣品酶活u/g%是否一次性稀釋

植酸酶+LC633P蛋雞5%536696.71是

植酸酶+LC633P蛋雞5%426176.8否

植酸酶5000u/g5548100否

由表3可知，預(yù)混料LC633P蛋雞5%添加植酸酶，在測定過程中一次性稀釋到位測定，使得測定的植酸酶酶活提高了1105u/g，即提高了19.91%。

3.小結(jié)與討論

預(yù)混料中添加KDN全細胞酶和植酸酶后對預(yù)混料中木聚糖酶酶活、植酸酶酶活測定結(jié)果表明，測定過程中緩沖液添加6%的EDTA·2Na、一次性稀釋到位直接測定可以明顯提高預(yù)混料中木聚糖酶或植酸酶酶活的測定值，可以更為客觀的反映預(yù)混料中添加酶制劑的酶活含量。選用LC633P蛋雞5%預(yù)混料作為實驗材料，是由于該預(yù)混料測得的木聚糖酶酶活、植酸酶酶活最低，選擇此預(yù)混料進行酶活測定方法的優(yōu)化，更能說明添加6% EDTA·2Na或一次性稀釋到位可以明顯提高酶活在預(yù)混料中的酶活實測值這個現(xiàn)象。添加6% EDTA·2Na使預(yù)混料中酶活實測值得到提高，原因是預(yù)混料中的一些重金屬離子與EDTA生成螯合物，減少了對酶蛋白的毒性影響;一次性稀釋到位法避開了分步稀釋法中的第一步稀釋中重金屬離子濃度太高對酶的毒性失活作用，可以提高預(yù)混料中酶活的測定值，而且添加酶進入飼料進入消化道也是一種一次性稀釋狀態(tài)，因此一次性稀釋到位測定酶活更加真實的反映了酶在動物消化道內(nèi)的實際情況，比較其它處理辦法而言，對實際生產(chǎn)更具有實際意義。此外，通過以上試驗表明，酶制劑添加到預(yù)混料中測定酶活值變化較大，并不能說明酶制劑在預(yù)混料中失活，而是測定方法需要不斷的改進和完善。本試驗為預(yù)混料中檢測酶活的測定方法建立提供了一種新的思路，完善了酶活測定方法。添加6% EDTA·2Na或一次性稀釋到位測定預(yù)混料中的酶活，是否也可以應(yīng)用到其它酶的酶活測定方法當(dāng)中，有待于進一步試驗和研究。