<button id="imseu"></button>
  • <rt id="imseu"></rt>
    

    <li id="imseu"><source id="imseu"></source></li>
    • 

    <button id="imseu"><input id="imseu"></input></button>
    <table id="imseu"></table>
    • <strike id="imseu"></strike>
    


    畜牧人
    
標題: 請大家幫我看看酶活低原因在哪 [打印本頁]
    

    
作者: wy0351    時間: 2011-2-14 09:56
    
標題: 請大家幫我看看酶活低原因在哪
    請教大家，幫我看看為什么我5000U的植酸酶測出來總是2000多一些，我用的挑戰的植酸酶。
    1、溶液配制：
    1.1.乙酸緩沖液(1)：稱取20.52g無水乙酸鈉于1000 ml燒杯中，加入900ml蒸餾水溶解，用冰乙酸調節pH至5.50±0.01，移至1000ml容量瓶中，蒸餾水定容至刻度。室溫下存放2個月有效。
    1.2.乙酸緩沖液(2)：稱取20.52g無水乙酸鈉，0.5 ml TritonX-100, 0.5g牛血清白蛋白于1000ml燒杯中，加入900ml蒸餾水溶解，用冰乙酸調pH至5.50±0.01，移至1000ml容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，室溫下存放2個月有效。
    

    
1.3.硝酸溶液：1+2水溶液。
    

    
1.4.鉬酸銨溶液：稱取10g鉬酸銨于100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解（微加熱），加入1ml氨水(25％)，用蒸餾水定容至刻度。
    

    
1.5.偏釩酸銨溶液：稱取0.235 g偏釩酸銨于100mL棕色容量瓶中，加50ml蒸餾水微加熱溶解，待溶液冷卻后加入2 mL硝酸溶液(1.3)，用蒸餾水溶解定容至刻度。避光條件下保存一周有效。
    1.6.顯色終止液：移取2份硝酸溶液(1.3)，1份鉬酸銨溶液(1.4)，1份偏釩酸銨溶液(1.5)混合后使用，現用現配。
    

    

    1.7．植酸鈉溶液：（sigmaP0109）稱取0.69g肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12)于100mL容量瓶中，用乙酸緩沖液(2)溶解并定容至刻度，現用現配(實際反應液中的最終濃度為5.0 mmol／L)。
    

    

    
1.8    基準物：準確稱取0.6804g在105℃烘至恒重的基準磷酸二氫鉀于100ml容量瓶中，用乙酸緩沖液（1）溶解，準確定容至刻度（濃度為50.0&micro;mol/ml）。
    2、測定步驟：
    2.1.標準曲線：
    

    按下列圖表用乙酸緩沖液(2)稀釋成不同濃度，與待測試樣一起反應測定
    標準稀釋比例
    標液序號
    稀釋倍數
    濃度/（&micro;mol/ml）
    1
    0.5→16
    1.5625
    2
    0.5→8
    3.125
    3
    0.5→4
    6.25
    4
    1→4
    12.5
    5
    1→2
    25

    

    

    

    

    
2.2.    樣品溶液制備：
    準確稱取植酸酶試樣1g，置于100ml容量瓶中，加入乙酸緩沖液（2）搖勻并定容至刻度，放入磁力棒，在磁力攪拌器上高速攪拌40min，將提取后的試樣在離心機上以4000r/min離心15min，取上清液1ml于100ml容量瓶中，用乙酸緩沖液（2）定容至刻度，使樣液濃度保持在0.5U/ml左右，待反應。
    2.3．反應步驟：
    取9支刻度試管，按下面順序進行操作，標準空白加0.2ml乙酸緩沖液(2)，
     
    反應順序
    樣品、標準
    樣品空白（標準空白）
    1、乙酸緩沖液1（ml）
    1.8
    1.8
    2、待反應液（ml）
    0.2
    0.2
    3、混合
    √
    √
    4、37℃水浴預熱5min
    √
    √
    5、依次加入底物溶液（ml）
    4
    4（第二步）
    6、混合
    √
    √
    7、37℃水浴水解30min
    √
    √
    8、依次加入終止液（ml）
    4
    4（第一步）
    9、混合
    √
    √
    2.4．樣品測定
    反應后將試樣在常溫下靜置10min，出現渾濁，然后在離心機上以4000r/min離心15min，取上清液以標準空白調零，在分光光度計波長為415nm處測出各個吸光值。
    以吸光值為橫坐標，摩爾量為縱坐標作圖。Y=kx+b
    3.計算公式：
        U=yn/0.2mt 
    U——試樣中植酸酶的活性，U／g；
    
y——根據實際樣液的吸光值由直線回歸萬程計算出的無機磷的量，（μmol）
    
n——試樣溶液反應前的總稀釋倍數,10000；
    
m——試樣質量g；
    
t——反應時間min。30min

    
     
     
    
作者: 海上龍卷風    時間: 2011-2-14 10:24
    
不同測定方法下酶活表現不一樣
    
作者: liyunhuddt    時間: 2011-2-14 10:48
    
要看你是不是和對方提供的檢驗方法一樣
    
作者: xyy169    時間: 2011-2-14 14:37
    
植酸酶是有國標方法的，你這個好像就是國標。
    
但酶制劑的檢測，不僅只是檢測方法的問題，更要注重的是操作細節，一個細節可能就是上幾倍，十幾倍的差距。
    
注意一下以下幾個方面：1、酶的溶出過程，包括時間，方法；2、緩沖液2中的牛血清白蛋白等是否有加（對有些植酸酶的影響非常大）；3、確定一下反應溫度，可另用溫度計測試；4、加底物量是否一致，包括間隔時間等細節多注意一下。
    
另外你拿一個你可以檢測到5000單位的標準樣品進行對比檢測，以確定你的操作和儀器是否正確等。
    
作者: wy0351    時間: 2011-2-14 16:50
    
回復 xyy169 的帖子
    

    
樓上的，您好，我測的是直接的植酸酶，高速磁力攪拌40min，不加熱的。緩沖液2中的牛血清白蛋白，去痛100我也都加了。水浴鍋溫度控制在37.0℃。加底物和終止液都是用的1~5ml量程移液槍加的。唯一一個間隔的時間我沒有太在意。我感覺連續加，時間不會差多少吧。難道就是這個在影響嗎？
    
作者: tianfangxu    時間: 2011-2-15 21:13
    
您好，我也是做酶制劑檢驗的，上次我也做了植酸酶，沒做出來，我把做曲線和做樣的曲線加的緩沖溶液加的搞錯了，我做曲線不是加的緩沖液，我加的蒸餾水。我希望我們可以多多交流酶制劑方面的問題。我最近又在糾結糖化酶......
    

    

    

    
補充內容：
    
您稀釋的是10000倍吧，您測的植酸酶活性是多大的？
    
作者: wy0351    時間: 2011-2-16 09:33
    
回復 tianfangxu 的帖子
    

    
我測的是5000U的植酸酶，稀釋10000倍
    

    
作者: wy0351    時間: 2011-2-16 11:36
    
回復 tianfangxu 的帖子
    

    
我前一段做一幾天糖化酶。。。
    
作者: hxz001    時間: 2011-2-16 14:11
    
4樓的意見比較客觀
    
作者: akenuma    時間: 2011-6-23 17:09
    
我們檢測稀釋800倍




    

    

    歡迎光臨 畜牧人 (http://www.www12347.com/)

Powered by Discuz! X3.5
    




主站蜘蛛池模板：
沁源县|
雷波县|
黑山县|
乌苏市|
华蓥市|
喜德县|
乌鲁木齐市|
永善县|
陇川县|
新竹县|
红原县|
广州市|
微山县|
四子王旗|
宜阳县|
囊谦县|
赤城县|
新余市|
浦东新区|
隆回县|
罗平县|
太仓市|
巴彦淖尔市|
平罗县|
南丹县|
武鸣县|
灌阳县|
哈巴河县|
岳阳县|
榆社县|
于田县|
定陶县|
大邑县|
邵阳县|
衡阳市|
桂平市|
冷水江市|
宣威市|
遂宁市|
邻水|
探索|