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標題: 大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化 [打印本頁]

作者: zimuluo 時間: 2009-10-12 22:18
標題: 大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化

大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化

一、基本原理
1、細菌轉化（transformation）：將外源DNA導入受體菌株使其由于捕獲了來自供體菌株的DNA而導致性狀特征發生遺傳改變的過程。提供轉化DNA的菌株叫做供體菌株，接受轉化DNA的細菌菌株則被稱為受體菌株。
2、感受態細胞：由于外源DNA本身不具備感染細胞的能力，為了使細胞能吸收外源DNA，就必須通過物理或化學處理改變受體細胞的生理狀態（細胞膜的通透性），使之具有很高的接受外源DNA的能力，這種經歷了處理的具有接受外源DNA能力的細胞叫做感受態細胞。
二、大腸桿菌作為基因工程宿主菌的優越性和局限性
1、優越性：
（1）大腸桿菌是迄今為止研究得最詳盡的原核生物
（2）已被發展成為一種安全的基因工程實驗體系，擁有各種宿主菌和載體
（3）培養簡單，繁殖迅速，培養代謝易于控制，易于進行工業化批量生產
（4）實驗已經證明，許多克隆的真核基因，如生長激素基因和胰島素基因等，都可在大腸桿菌中實現高效表達
2、局限性：
（1）不具備真核生物的蛋白質復性系統
（2）缺乏真核生物蛋白質加工修飾系統
（3）內源蛋白酶易降解空間構象不正確的異源蛋白，造成表達產物不穩定
（4）細胞膜間隙含有大量內毒素，可導致人體熱原反應
三、大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化方法
1、CaCl2法
（1）CaCl2法是制備大腸桿菌感受態細胞最常用的化學方法。
（2）優點：易操作，費用低，無需特殊設備。缺點：所制備的感受態細胞轉化率低。
（3）原理：將快速生長的大腸桿菌細胞置于經低溫（0℃）預處理的低滲CaCl2溶液中，細胞膨脹，細胞膜通透性發生變化，易與外源DNA黏附并在細胞表面形成復合物。此時，42℃熱激，外源DNA就可能被細胞吸收。
（4）技術要點：使菌體始終保持低溫狀態；為防止污染，要在超凈臺上操作；所有容器都要高溫高壓滅菌并預冷；操作既要謹慎，又要迅速。
（5）改良Hanahan法：此法是在CaCl2法基礎上發展而成，轉化率是普通CaCl2法的10～100倍。主要是緩沖液的改良（TB buffer），其中使用二甲基亞砜（DMSO）和二巰基蘇糖醇（DTT）。
2、電擊法：
（1）電擊法制備的感受態細胞比CaCl2法穩定、轉化率高100～1000倍，但費用較高。需要電轉化儀。
（2）原理：利用瞬間高壓使細胞膜產生小孔而接受外源DNA。
（3）步驟：將對數生長期的E.coli菌液冷卻至4℃離心，用相同溫度的純水洗滌，用10％的甘油懸浮后將高密度菌液置于特制的電極杯中進行電擊。
（4）技術要點：低溫操作；注意污染；操作中需要將DNA溶液中的鹽分全部去掉，否則因鹽分而產生高電流，高電流產生火花而殺死E.coli。脫鹽一般采用乙醇沉淀DNA的方法。

作者: guangyaoxinyu 時間: 2010-5-14 22:16
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