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畜牧人

標(biāo)題: 鹽霉素的檢測 [打印本頁]

作者: Elen 時(shí)間: 2009-8-3 15:31
標(biāo)題: 鹽霉素的檢測
請(qǐng)問配合飼料中的鹽霉素如何檢測，檢測的準(zhǔn)確性如何？

作者: wangyuxia1234 時(shí)間: 2009-8-3 15:56
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作者: nzhqlucky 時(shí)間: 2009-8-3 17:10

高效液相檢測鹽霉素效價(jià)

一、
鹽霉素效價(jià)檢測現(xiàn)有方法簡介：
鹽霉素效價(jià)檢測使用的是微生物效價(jià)測定法中的管碟法，是利用微生物在特定培養(yǎng)基上的擴(kuò)散作用，用已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)溶液與未知效價(jià)的樣品溶液在含有短小芽孢桿菌的特定培養(yǎng)基上對(duì)照培養(yǎng)，根據(jù)產(chǎn)生抑菌圈的大小來計(jì)算樣品的含量。
二、
課題選擇
由于傳統(tǒng)的微生物測定法耗時(shí)長、誤差大，重現(xiàn)性差、成本高等諸多弊端，已不能滿足現(xiàn)代化生產(chǎn)的需要，隨著現(xiàn)代化生產(chǎn)的需要，隨著中國加入世貿(mào)組織和企業(yè)進(jìn)行FDA認(rèn)證，企業(yè)面對(duì)的市場不僅僅是國內(nèi)，而且還有國外市場，目前歐洲許多國家已不再使用微生物測定法測定藥品的含量，而是改用先進(jìn)的、更可信的HPLC法，因此為了提高檢測的準(zhǔn)確度，進(jìn)一步完善鹽霉素產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，選擇“高效液相檢測鹽霉素效價(jià)”。
三、
現(xiàn)狀調(diào)查
1)
檢測方法的調(diào)查          抑菌圈圓正及大小的影響

   標(biāo)準(zhǔn)品與供試品不同質(zhì) 藥液的飛濺          培養(yǎng)基內(nèi)有小凝塊
培養(yǎng)基溫度不均勻

器具被污染
含有影響抗菌活性    試劑中賦型劑的影響
                           培養(yǎng)基雜質(zhì)

鋼管底部不平滑
物標(biāo)準(zhǔn)品與供試品不同

                                 緩沖液ph和鹽濃度的影響

培養(yǎng)基溫度、擴(kuò)散
所用緩沖液不同

溶解所用溶劑不相同

批

                                                系數(shù)、溶液濃度



                                                   方法誤差

細(xì)菌生長時(shí)間不同       菌種分離純化不及時(shí)

檢定菌放置時(shí)間過長

               檢定菌                   恒溫室溫度不穩(wěn)定
2)
檢測成本調(diào)查：生測法所使用的試劑多達(dá)10種以上，370恒溫室耗電量大，所用玻璃器皿成本高，致使單批測量成本60元左右，工段月成本高達(dá)12000元。
3)
人員調(diào)查：崗位化驗(yàn)員雖有多年工作經(jīng)驗(yàn)，但由于檢測方法完全由手工操作，過程繁瑣，工作量大，影響因素較多，易出現(xiàn)操作誤差，且人員的工作效率較低。
4)
儀器調(diào)查：抑菌圈測定儀重復(fù)掃描，重現(xiàn)性差，誤差在1-2％,致使同批樣品精確度差不能確保有良好的準(zhǔn)確度。
5)
試劑調(diào)查：所用試劑種類繁多，雜質(zhì)含量高，影響擴(kuò)散系數(shù)，從而造成測定結(jié)果不穩(wěn)定。
6)
環(huán)境因素調(diào)查：因?yàn)楸粡U棄的培養(yǎng)基內(nèi)帶有活的菌體，排放后對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染。
四、
活動(dòng)目標(biāo)
1)
使檢測誤差控制在5％以下，提高檢測的準(zhǔn)確度。
2)
減少勞動(dòng)量，節(jié)省人員，降低單批測定的成本。
3)
避免帶活菌體污物的排放，減少環(huán)境污染。
原因分析：降低檢測偏差的可控因素進(jìn)行分析。

降低偏差

改變現(xiàn)有的檢測方法

降低成本

盡量減少手工操作

選用更為精密的儀器

加強(qiáng)崗位員工的培訓(xùn)

造成偏差較大的因素有以下幾種：

放置時(shí)間過長

菌絲

雜菌的影響

Ph及鹽濃度不合規(guī)定

恒溫室溫度不穩(wěn)定

組分配不同

物質(zhì)不同

賦型劑的影響

鑒定菌的質(zhì)量

操作條件

加熱溫度過高

標(biāo)準(zhǔn)品與供試品不同質(zhì)

檢測方法

被污染

雜質(zhì)引起菌種擴(kuò)散

擴(kuò)散系數(shù)

操作人員技能

習(xí)慣操作太多

試劑純度

理論知識(shí)薄弱

操作不規(guī)范

檢測偏差大

人員的主觀意識(shí)

儀器損耗

改用新方法，以提高檢測的準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性，使誤差控制在5％以下，并降低檢測成本。

對(duì)上述找出的可控因素進(jìn)行分析確認(rèn)：

序號(hào)
原因
要素確認(rèn)
是否原因
備注
1.

檢測方法
檢測偏差超出5％
是

2.

儀器的穩(wěn)定性
重復(fù)測定誤差在1-2％
是

3.

人員的主觀意識(shí)
手工操作煩瑣，失誤較多
是

4.

試劑的純度
雜質(zhì)有可能對(duì)測定結(jié)果產(chǎn)生影響
否

5.

標(biāo)準(zhǔn)品與供試品不同質(zhì)
二者直線不平行，斜率不等
否

6.

操作人員技術(shù)不穩(wěn)定
試驗(yàn)操作誤差
是

7.

檢定菌的質(zhì)量
影響抑菌圈的清晰度形成
否

8.

擴(kuò)散系數(shù)
測定結(jié)果的穩(wěn)定性
是

9.

操作條件
影響抑菌圈的圈正和大小以及培養(yǎng)溫度不穩(wěn)定從而影響測定結(jié)果
是

10.

11.

六制定對(duì)策
（一）我們對(duì)以上分析找出關(guān)鍵因素制定對(duì)策：

序號(hào)
要因
現(xiàn)狀
措施
完成時(shí)間
主要負(fù)責(zé)人
1
標(biāo)準(zhǔn)品與供試品不同
引起檢測誤差過大超過5%
尋找新的方法改變要因?qū)y量結(jié)果的影響

2
擴(kuò)散系數(shù)

3
操作條件

4
操作人員技術(shù)不穩(wěn)定

5
儀器的穩(wěn)定性
穩(wěn)定性差
選用更為先進(jìn)的儀器

6
人員的主觀意識(shí)和技能
理論知識(shí)及操作技能較差、習(xí)慣操作太多
加強(qiáng)培訓(xùn)、提高水平

（二）加強(qiáng)培訓(xùn)與考核為度
利用工段會(huì)的機(jī)會(huì)對(duì)崗位員工進(jìn)行授課，培訓(xùn)HPL的理論及實(shí)際操作知識(shí)，使每位員工都能熟練掌握操作技能，改變習(xí)慣性操作，并符合GMP的規(guī)定，盡可能地減小操作偏差更好地服務(wù)生產(chǎn)，同時(shí)加大考核及抽檢的力度，加強(qiáng)員工的責(zé)任心，從而督促每一位員工加強(qiáng)學(xué)習(xí)，不斷提高干好本職工作。
七　對(duì)策實(shí)施：
針對(duì)檢測方法中引起偏差的原因我們計(jì)劃采用：藥典及國際通用的HPLC法檢測鹽鹽霉素含量，從而達(dá)到降低偏差、減少工作量、提高工作效率，增加數(shù)據(jù)可信度，提高產(chǎn)品質(zhì)量信譽(yù)。查閱有關(guān)資料及文獻(xiàn)，使用
**方法并對(duì)方法中的色譜條件進(jìn)行論證

1.
固定條件：
確定設(shè)備條件：（Agilend1100高效液相色譜儀）表、L18反相色譜柱、20ml定量環(huán)
2.
色譜條件的論證（甲醇V：香草醛W：硫酸V＝95：4：0.6）流速0.6ml/min,柱溫35℃、反應(yīng)溫度100℃、檢測波長520nm。
（1）
流動(dòng)相比：甲醇V：冰乙酸V：水V
制備配比為93：7：0.1、94：6：0.1、95：5：0.1、96：4：0.1、96.4：3.6：0.1、97：3：0.1六種流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相含量高時(shí)，靈敏度和峰面積都有較高的表現(xiàn)，但有沒有分開的峰，有機(jī)相低時(shí)雖然所有的峰分離效果很好，但其響應(yīng)卻低，有機(jī)相含量在95－96%時(shí)較好的分離及響應(yīng)值，選擇配比95：5：0.1做為流動(dòng)相配比。
（2）流動(dòng)相流速的確定：流動(dòng)相配比按95：5：0.1時(shí)選拔擇流速，使用0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min七種流速發(fā)現(xiàn)流速低時(shí)響應(yīng)值及分離度都有較好的表現(xiàn)，原因是因?yàn)榱魉俚蜁r(shí)，柱的反應(yīng)能有充分的時(shí)間，但其峰形和出峰時(shí)間較差，流速高時(shí)峰形好但其響應(yīng)及分離度不好，權(quán)衡利弊，確定流速為0.8ml/min為宜
（3）衍生劑濃度的探索，流動(dòng)相配比（95：5：0.1）。流速為0.8ml/min.先用四種配比，甲醇v:香草w:濃硫酸v(95 :32:0.5,95:4:0.5,95:5:0.5,95:6;0.5)，香草濃度在4%以上時(shí)響應(yīng)值和分離度較好，沒有太大的改變。而濃度低時(shí)由于反應(yīng)不會(huì)完全而響應(yīng)值不高。再提高硫酸的濃度為0.6時(shí)。響應(yīng)值更好，所以選擇了95：4：0.6。
（4）反應(yīng)池溫度的探索，
固定條件：流動(dòng)相配比為（958：5：0.1）流速為0.8ml/min.衍生劑配比為95：4：0.6，選擇溫度90oc,95 oc,100 oc,105 oc,110 oc,隨著反應(yīng)池溫度的提高，響應(yīng)值有所提高，峰型不受影響，但溫度過高儀器受到的傷害較大，長期受高溫對(duì)反應(yīng)池也有腐蝕，不能長時(shí)間使用，選定100 oc時(shí)其響應(yīng)值就能滿足要求。
（5）柱溫度的探索
固定條件：流動(dòng)相配比為（95：5：0.1）流速為0.8ml/min,衍生配比95：5：0.6反應(yīng)池溫度為100 oc
改變柱溫度分別為25oc,30 oc,35 oc,40 oc,45 oc,5種情況，發(fā)現(xiàn)只有出峰時(shí)間響應(yīng)值有較小改變峰型基本上不變。由于溫度過高可能導(dǎo)致固定相的長期流失引起柱效減低，故在常溫下操作即可，柱溫度確定為35 oc
（6）進(jìn)樣量的探索
固定條件：流動(dòng)相配比為（95：5：0.1）流速為0.8ml/min,衍生劑（95：5：0.6）流速0.3 ml/min反應(yīng)池溫度為100 oc，柱溫度35 oc
選用20μl的定量環(huán)，進(jìn)樣濃度為1000μ/ml,800μ/ml,500μ/ml,200μ/ml,100μ/ml,150μ/ml.發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣量高時(shí)，峰的對(duì)稱性不好，有可能引起超載，大大縮短色譜柱的壽命，進(jìn)樣量太少則引起相對(duì)誤差較大，建議濃度為100μ/ml即為2μg
3最佳色譜條件的確定：
檢測波長：520nm,流動(dòng)相配比甲醇V：冰乙酸V:水V=95:5:0.1,流速0.8ml/min衍生劑配比（甲醇v:香草w:濃硫酸）95：4：0.6，衍生劑流速0.6ml/min，反應(yīng)池溫度100 oc，柱溫度35 oc，進(jìn)樣量為2μg
流動(dòng)相及衍生劑必須經(jīng)過脫氣防止氣泡產(chǎn)生
4 樣品提取，根據(jù)估計(jì)效價(jià)精確稱取一定量的樣品，用20ml的色譜極甲醇提取，浸泡30min ,震蕩提取30min，過濾棄去初濾液，再取1ml至10ml容量瓶中定容得100μ/ml的樣品用0.45μm的微孔濾膜過濾即可進(jìn)樣。
5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備：精確稱取50mg左右的標(biāo)準(zhǔn)品至50ml容量瓶中，用甲醇定容再分別吸取2.25ml，2.5 ml，2.75 ml的標(biāo)準(zhǔn)液至25 ml容量瓶中，即得10μ/ml，100μ/ml，110μ/ml的標(biāo)準(zhǔn)液做儲(chǔ)備液，用來作曲線，用外標(biāo)法測鹽霉素含量。
八效果檢查：
1)
色普條件
C18反相色普柱（大連依利特）流動(dòng)相（甲醇V：水V：冰V＝95.5：4.5：0.1），流速0.8ML/MIN,衍生劑（甲醇V：香草醛W：硫酸V＝95：4：0.6）20UL定量環(huán)，柱溫350c，反應(yīng)池溫度1000c，檢測波長7MIN左右。
2）準(zhǔn)確度
在已知含量的鹽霉素粉劑和顆粒中添加一定量的對(duì)照品，再做添加后樣品中鹽霉素的含量。算得樣品添加含量回收率如下表：

已知含量ug/mg
添加后含量ug/mg
回收量ug/mg
回收率％
平均回收率％

F1
131.68
146.47
145.85
99.6
99.73

F2
131.68
146.47
146.57
100.1

F3
131.68
146.67
145.85
99.6

K1
125.59
140.46
140.89
100
99.49

K2
125.59
140.66
139.95
99.5

K3
125.59
143.51
142.05
98.98

2)
線性及線性范圍
配制90u/ml, 95u/ml、 100u/ml、 110u/ml系列標(biāo)準(zhǔn)液,并利用面積作為響應(yīng)值，作曲線得Area=3.34989Amt+1.3.278,相關(guān)系數(shù)r=0.9999,說明其在1.8ug-2.2ug之間具有良好的線性。
3)
精確度
對(duì)同一批粉劑和顆粒分別作三個(gè)平行樣得結(jié)果如下表：

測得含量ug/mg
平均含量ug/mg
RSD%
平均RSD%

F1
131.04
131.68
0.5
0.6

F2
132.53

0.6

F3
131.49

0.7

K1
126.95
125.59
1.1
0.7

K2
124.72

0.7

K3
125.11

0.4

4)
樣品穩(wěn)定性
對(duì)同一樣品進(jìn)行放置一段時(shí)間測量，得如下數(shù)據(jù)，說明樣品24小時(shí)之內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性：

2h
4h
8h
20h
24h

A
309
308
308
307
307

5)
重現(xiàn)性
對(duì)同一樣品重復(fù)進(jìn)樣三次，所得數(shù)據(jù)如下表，說明此方法具有較好的重現(xiàn)性。

出峰時(shí)間
峰面積
峰高
峰寬

1
7.109
304.0
27.7
0.1688

2
7.125
304.4
28.0
0.1690

3
7.131
303.0
27.8
0.1678

由于傳統(tǒng)的生物測定法，耗時(shí)長、誤差大、重現(xiàn)性差等弊端已不能滿足現(xiàn)代化生產(chǎn)的要求。而本方法具有良好的精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度并且簡單易行。為進(jìn)一步完善鹽霉素產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了良好的檢測方法。

作者: nzhqlucky 時(shí)間: 2009-8-3 17:14
高效液相色譜柱后衍生化法測定飼料中鹽霉素張素霞
沈建忠
賈明宏
［摘要］對(duì)高效液相色譜柱后衍生化測定飼料中鹽霉素的方法作驗(yàn)證研究。采用C18反相柱，甲醇—冰乙酸—水為流動(dòng)相，香草醛為衍生劑。方法檢測極限為0.5μg/ml，添加回收率為85.6%，變異系數(shù)為4.92%。
　　關(guān)鍵詞　高效液相色譜柱后衍生化　鹽霉素　　鹽霉素(Salinomycin)是一種聚醚類單羧酸化合物，鹽霉素鈉鹽作為一種飼料添加劑主要用于防治家禽球蟲病，也用于改善肉雞生產(chǎn)性能，其在飼料中的添加濃度為60mg/kg，當(dāng)濃度超過100mg/kg時(shí)則對(duì)肉雞生產(chǎn)性能產(chǎn)生不良影響。
　　最初對(duì)飼料中鹽霉素的檢測方法主要為比色法及生物測定法。80年代后發(fā)展了采用各種衍生劑的高效液相色譜法，其中高效液相色譜柱后衍生化法(HPLC—PCD)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快速、便于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。國外已有一些研究報(bào)道，國內(nèi)這方面的研究工作剛剛開始，我們采用香草醛為衍生劑，進(jìn)行了高效液相色譜柱后衍生化測定飼料中鹽霉素的方法研究，取得了良好結(jié)果。
1　材料與方法
1.1　儀器和試劑　高效液相色譜儀(泵SP8810，紫外檢測器SP8450，積分儀SP4270)，北分BFS—5106型柱后衍生化裝置，鹽霉素標(biāo)樣(美國Sigma公司)，甲醇(優(yōu)級(jí)純)，蒸餾水為全玻璃重蒸，香草醛等其余試劑為分析純。
1.2　標(biāo)準(zhǔn)品和溶液的配制
　　流動(dòng)相：甲醇—冰乙酸—水(940∶60∶1，v/v)；
　　香草醛衍生液：將20g香草醛溶于冷卻的甲醇—硫酸(250+5，v+v)溶液中，避光，現(xiàn)用現(xiàn)配；
　　樣品提取液：甲醇—水(90∶10，v∶v)
　　標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取一定量的鹽霉素標(biāo)樣，用甲醇配制成1000μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用甲醇—水(90∶10，v/v)稀釋成2.0、5.0、10.0、25.0μg/ml系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.3　飼料樣本的提取　稱取20g飼料樣品于250ml具塞三角瓶中，加入100ml樣品提取液，在往復(fù)震蕩器上震蕩45分鐘，靜止片刻，過濾上清液，取部分上清液用0.45μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC—PCD測定。
　　樣本添加回收率的測定設(shè)3個(gè)添加水平，濃度分別為30、60、120mg/kg，每個(gè)水平作3個(gè)重復(fù)，樣本的前處理過程同上。
2　結(jié)果
2.1　色譜條件及保留時(shí)間
　　色譜柱：C18反相柱，250×4.6mm id，粒徑5μm；
　　檢測波長：520nm
　　流動(dòng)相流速：0.8ml/min
　　衍生液流速：1.6ml/min
　　反應(yīng)溫度：95℃
　　反應(yīng)管：0.2mm×10m
　　進(jìn)樣體積：200μl
　　鹽霉素的保留時(shí)間：13.6分鐘
2.2　標(biāo)準(zhǔn)曲線
　　在上述色譜條件下，測定標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度系列的響應(yīng)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為Y＝-152.2+383.0X，相關(guān)系數(shù)為0.9992。
濃度(μg/g)
2.3　添加回收率
　　3個(gè)水平3個(gè)重復(fù)的添加回收率見附表。
附表　飼料中鹽霉素添加回收率
　檢測濃度 μg/g回收率 %變異系數(shù) %
3024.581.7
3027.090.0
3026.588.3
平均值26.086.75.05
6048.080.0
6054.590.8
6052.587.5
平均值51.786.16.42
12098.081.7
120100.083.3
120104.587.1
平均值100.884.03.30
3　討論
　　本文研究了使用高效液相色譜柱后衍生化系統(tǒng)測定飼料中鹽霉素的方法，通過參考有關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行了對(duì)流動(dòng)相的組成、香草醛衍生液的濃度、流動(dòng)相和衍生液的流速比例等測試條件的多次試驗(yàn)，選擇了上述的最佳色譜條件。從表1可以看出：使用高效液相色譜柱后衍生化法測定飼料中鹽霉素回收率較高，在30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg3個(gè)水平上的平均回收率分別為86.7%、86.1%和84.0%，而且在每個(gè)水平上的3個(gè)重復(fù)變異系數(shù)都較低，分別為5.05%、6.42%和3.30%。另外，從鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程還可看出，使用高效液相色譜柱后衍生化法測定飼料中鹽霉素線性相關(guān)非常理想。
　　試驗(yàn)證明本方法操作簡便易行，色譜條件易于掌握，測試數(shù)據(jù)重復(fù)性好，回收率較高，精密度和準(zhǔn)確度都能滿足分析要求，是測定飼料中鹽霉素的可行方法。

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降低偏差	改變現(xiàn)有的檢測方法	降低成本

	盡量減少手工操作

	選用更為精密的儀器

	加強(qiáng)崗位員工的培訓(xùn)

序號(hào)	原因	要素確認(rèn)	是否原因	備注
1.	檢測方法	檢測偏差超出5％	是
2.	儀器的穩(wěn)定性	重復(fù)測定誤差在1-2％	是
3.	人員的主觀意識(shí)	手工操作煩瑣，失誤較多	是
4.	試劑的純度	雜質(zhì)有可能對(duì)測定結(jié)果產(chǎn)生影響	否
5.	標(biāo)準(zhǔn)品與供試品不同質(zhì)	二者直線不平行，斜率不等	否
6.	操作人員技術(shù)不穩(wěn)定	試驗(yàn)操作誤差	是
7.	檢定菌的質(zhì)量	影響抑菌圈的清晰度形成	否
8.	擴(kuò)散系數(shù)	測定結(jié)果的穩(wěn)定性	是
9.	操作條件	影響抑菌圈的圈正和大小以及培養(yǎng)溫度不穩(wěn)定從而影響測定結(jié)果	是
10.
11.

序號(hào)	要因	現(xiàn)狀	措施	完成時(shí)間	主要負(fù)責(zé)人
1	標(biāo)準(zhǔn)品與供試品不同	引起檢測誤差過大超過5%	尋找新的方法改變要因?qū)y量結(jié)果的影響
2	擴(kuò)散系數(shù)
3	操作條件
4	操作人員技術(shù)不穩(wěn)定
5	儀器的穩(wěn)定性	穩(wěn)定性差	選用更為先進(jìn)的儀器
6	人員的主觀意識(shí)和技能	理論知識(shí)及操作技能較差、習(xí)慣操作太多	加強(qiáng)培訓(xùn)、提高水平

	已知含量ug/mg	添加后含量ug/mg	回收量ug/mg	回收率％	平均回收率％
F1	131.68	146.47	145.85	99.6	99.73
F2	131.68	146.47	146.57	100.1
F3	131.68	146.67	145.85	99.6
K1	125.59	140.46	140.89	100	99.49
K2	125.59	140.66	139.95	99.5
K3	125.59	143.51	142.05	98.98

	測得含量ug/mg	平均含量ug/mg	RSD%	平均RSD%
F1	131.04	131.68	0.5	0.6
F2	132.53		0.6
F3	131.49		0.7
K1	126.95	125.59	1.1	0.7
K2	124.72		0.7
K3	125.11		0.4

	出峰時(shí)間	峰面積	峰高	峰寬
1	7.109	304.0	27.7	0.1688
2	7.125	304.4	28.0	0.1690
3	7.131	303.0	27.8	0.1678