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畜牧人

標(biāo)題: 禽流感抗體濫測血凝和血凝抑制試驗 [打印本頁]

作者: nsqs020701 時間: 2009-6-29 13:03
標(biāo)題: 禽流感抗體濫測血凝和血凝抑制試驗

血凝抑制（HI）試驗

流感病毒顆粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有識別并吸附于紅細(xì)胞表面受體的結(jié)構(gòu)，HA試驗由此得名。HA蛋白的抗體與受體的特異性結(jié)合能夠干擾HA蛋白與紅細(xì)胞受體的結(jié)合從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。
該試驗是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試驗方法。可用于流感病毒分離株HA亞型的鑒定，也可用來檢測禽血清中是否有與抗原亞型一致的感染或免疫抗體。
HA-HI試驗的優(yōu)點是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試驗方法，可用來鑒定所有的流感病毒分離株，可用來檢測禽血清中的感染或免疫抗體。它的缺點是只有當(dāng)抗原和抗體HA亞型相一致時才能出現(xiàn)HI象，各亞型間無明顯交叉反應(yīng)；除雞血清以外，用雞紅細(xì)胞檢測哺乳動物和水禽的血清時需要除去存在于血清中的非特異凝集素，對于其它禽種，也可以考慮選用在調(diào)查研究中的禽種紅細(xì)胞；需要在每次試驗時進(jìn)行抗原標(biāo)準(zhǔn)化；需要正確判讀的技能。
1
阿氏（Alsevers）液配制
稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa 15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/font>
2
10%和1%雞紅細(xì)胞液的制備
2.1采血
用注射器吸取阿氏液約1mL，取至少2只SPF雞（如果沒有SPF雞，可用常規(guī)試驗證明體內(nèi)無禽流感和新城疫抗體的雞），采血約2～4mL，與阿氏液混合，放入裝10mL阿氏液的離心管中混勻。
2.2 洗滌雞紅細(xì)胞
將離心管中的血液經(jīng)1500～1800 r/min 離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液，輕輕混合，再經(jīng)1500～1800 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再重復(fù)2次以上過程后，加入阿氏液20 mL，輕輕混合成紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆茫怀^5天。
2.3
10%雞紅細(xì)胞懸液
取阿氏液保存不超過5天的紅細(xì)胞，在錐形刻度離心管中離心1500～1800 r/min 8分鐘，棄去上清液，準(zhǔn)確觀察刻度離心管中紅細(xì)胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的生理鹽水，用吸管反復(fù)吹吸使生理鹽水與紅細(xì)胞混合均勻。
2.4
1%雞紅細(xì)胞液
取混合均勻的10%雞紅細(xì)胞懸液1 mL，加入9 mL生理鹽水，混合均勻即可。
3 抗原血凝效價測定（HA試驗，微量法）
3.1 在微量反應(yīng)板的1孔～12孔均加入0.025mL PBS，換滴頭。
3.2吸取0.025mL病毒懸液（如感染性雞胚尿囊液）加入第l孔，混勻。
3.3從第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混勻后吸取0.025mL加入第3孔，如此進(jìn)行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄之，換滴頭。
3.4每孔再加入0.025mL PBS。
3.5每孔均加入0.025mL 體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液（將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入）見附錄B。
3.6振蕩混勻，在室溫（20～25℃）下靜置40min后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下反應(yīng)1小時）。對照孔紅細(xì)胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。
3.7結(jié)果判定
將板傾斜，觀察血凝板，判讀結(jié)果（見下表）。

表1：血凝試驗結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

類別	孔底所見	結(jié)果
1 2 3 4 5	紅細(xì)胞全部凝集，均勻鋪于孔底，即100%紅細(xì)胞凝集紅細(xì)胞凝集基本同上，但孔底有大圈紅細(xì)胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝塊紅細(xì)胞于孔底形成小圓點，四周有少許凝集塊紅細(xì)胞于孔底呈小圓點，邊緣光滑整齊，即紅細(xì)胞完全不凝集	++++ +++ ++ + -

能使紅細(xì)胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為1個血凝單位（HAU）。注意對照孔應(yīng)呈現(xiàn)完全不凝集（-），否則此次檢驗無效。
4 血凝抑制（HI）試驗（微量法）
4.1 根據(jù)3的試驗結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點，終點稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點滴度為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。
4.2 在微量反應(yīng)板的1孔～11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。
4.3 吸取0.025mL血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025mL于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。
4.4 1孔～11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025mL，室溫（約20℃）靜置至少30min。
4.5 每孔加入0.025mL體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進(jìn)行），對照紅細(xì)胞將呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。
4.6 結(jié)果判定
以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。
只有陰性對照孔血清滴度不大于21og2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結(jié)果才有效。HI價小于或等于21og2判定HI試驗陰性；HI價等于31og2為可疑，需重復(fù)試驗；HI價大于或等于41og2為陽性。

作者: quancheng5566 時間: 2010-2-6 11:39
不錯的資料。值得借鑒。

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