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畜牧人

標題: 豬病實驗室常規診斷技術（連載）之七、豬瘟檢測方法 [打印本頁]

作者: nnii521 時間: 2009-6-23 22:02
標題: 豬病實驗室常規診斷技術（連載）之七、豬瘟檢測方法

七、豬瘟檢測方法

豬瘟間接血凝試驗操作方法

（一）試驗材料

1．96孔110~120°V型醫用血凝板

2．10~100微升可調微量移液器

3．塑料咀

4．豬瘟間接血凝抗原（豬瘟正向血凝診斷液），每瓶5毫升，可檢測血清25~30頭份

5．陽性對照血清，每瓶2毫升；陰性對照血清，每瓶2毫升

6．稀釋液每瓶10毫升

7．待檢血清每份0.2~0.5毫升（56℃水浴滅活30分鐘）

（二）操作步驟

1．檢測前，應將凍干診斷液，每瓶加稀釋液5毫升浸泡7~10天后方可應用。

2．稀釋待檢血清：在血凝板上的第1孔~第6孔各加稀釋液50微升。吸取待檢血清50微升加入第1孔，混勻后從中取出50微升加入第2孔，依此類推直至第6孔混勻后丟棄50微升，從第1孔——第6孔的血清稀釋度依次為1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64。

3．稀釋陰性和陽性對照血清：在血凝板上的第11排第1孔加稀釋液60微升，取陰性血清20微升混勻取出30微升丟棄。此孔即為陰性血清對照孔。

在血凝板上的第12排第1孔加稀釋液70微升，第2——7孔各加稀釋液50微升，取陽性血清10微升加入第1孔混勻，并從中取出50微升加入第2孔混勻后取出50微升加入第3孔……直到第7孔混勻后棄50微升，該孔的陽性血清稀釋度為1：512。

4．在血凝板上的第1排第8孔加稀釋液50微升，作為稀釋液對照孔。

5．判定方法和標準：先觀察陰性血清對照孔和稀釋液對照孔，紅血球應全部沉入孔底，無凝集現象（—）或呈（+）的輕度凝集為合格；陽性血清對照應呈（+++）凝集為合格。

在以上3孔對照合格的前提下，觀察待檢血清各孔的凝集程度，以呈“++”凝集的待檢血清最大稀釋度為其血凝效價（血凝價）。血清的血凝價達到1：16為免疫合格。

“-”表示紅細胞100%沉于孔底，完全不凝集

“+”表示約有25%的紅細胞發生凝集

“++”表示50%紅細胞出現凝集

“+++”表示75%紅細胞凝集

“++++“表示90—100%紅細胞凝集

6．注意事項

（1）
勿用90°或130°血凝板，以免誤判。

（2）
污染嚴重或溶血嚴重的血清樣品不宜檢測。

（3）
凍干血凝抗原，必須加稀釋液浸泡7~10天，方可使用，否則易發生自凝現象。

（4）
用過的血凝板，應及時沖冼干凈，勿用毛刷或其他硬物刷洗板孔，以免影響孔內光潔度。

（5）
使用血凝抗原時，必須充分搖勻，瓶底應無血球沉積。

（6）
液體血凝抗原4~8℃貯存有效期四個月，可直接使用。凍干血凝抗原4~8℃貯存有效期三年。

（7）
如來不及判定結果或靜置2小時結果不清晰，也可放置第2天判定。

（8）
每次檢測，只設陰性、陽性血清和稀釋液對照各1孔。

（9）
稀釋不同的試劑要素時，必須更換塑料咀。

（10）血凝板和塑料咀洗凈后，自然干燥，可重復使用。

(李樹春)

豬瘟病毒強弱毒鑒別診斷ELISA操作方法

（一）試驗材料

1．豬瘟弱毒單抗純化酶聯抗原和豬瘟強毒單抗純化酶聯抗原，分別供檢測經豬瘟弱毒疫苗免疫后產生的抗體和感染豬瘟強毒后產生的抗體之用。

2．酶標抗體

3．豬瘟陽性、陰性血清

4．酶聯板及其他必要的試劑。

（二）操作步驟

1．用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯抗原、豬瘟強毒單抗純化酶聯抗原各作100倍稀釋，以100微升分別加入做好標記的酶聯板孔中，置濕盒于4℃過夜。

2．棄去孔內液體。用洗滌液沖洗酶聯板3次，每次間隔3~5分鐘，拍干。
3．用稀釋液將待檢血清作400倍稀釋，每孔加100微升。同時，將豬瘟陽性、陰性血清以100稀釋作對照，37℃培育1.5~2小時。
4．重復第2步。
5．用稀釋液將兔抗豬IgG—辣根過氧化物酶結合物作100倍稀釋，每孔加入100微升，37℃培育1.5~2小時。
6．重復第2步。

7．每孔加入底物溶液（每塊板所需的底物溶液按鄰苯二胺5毫克+底物緩沖液5毫升+30%過氧化氫18.75微升配制）100微升，室溫下觀察顯色反應（一般陰性對照孔略微顯色，立即終止反應，并以陰性孔作空白調零）。
8．每孔加入終止液50微升，于酶聯讀數儀上測定490nm波長的光密度（OD）。
（三）判定標準
在豬瘟弱毒酶聯板上：OD>0.2為豬瘟弱毒抗體陽性

OD<0.2為豬瘟弱毒抗體陰性
在豬瘟強毒酶聯板上：OD≥0.5為豬瘟強毒抗體陽性

OD<0.5為豬瘟強毒抗體陰性
（四）注意事項

1．運輸單抗純化酶聯抗原時，必須使用冰盒低溫運輸；豬瘟強弱毒單抗純化酶聯抗原在4℃保存6個月，在—18℃保存12個月。

2．配制洗滌液時，應使用新鮮蒸餾水或無離子水，每次洗板后，盡量不使孔中有殘余液體，以免影響結果。

3．底物溶液應臨用前配制，待鄰苯二胺完全溶解于底物緩沖液后再加過氧化氫，混勻后立即加入孔中。
1．
終止反應后，應立即讀數。

(中國獸藥監察所)

豬瘟反轉錄聚合酶鏈反應

1．材料準備：待檢組織，勻漿器、氯仿、異丙醇、75%乙醇、生理鹽水，RNA提取試劑盒（Omega），RT-PCR試劑盒（TakaRa）等。
引物：擴增豬瘟病毒E2基因中585bp基因片段，由上海生物工程公司合成。
序列為：上游引物P1：5’—CCTGCAAGGAAGATCACACG—3’
下游引物P2：5’—CCGTGTAGGTCACTGGTTCA—3’
儀器設備為：PCR擴增儀，電泳儀，凝膠電泳紫外檢測儀。
2．操作步驟
2．1 樣品采集：動物病死或撲殺后，取扁桃體、淋巴結和脾組織，-20℃冷藏。
2．2 樣品處理：所采病料經組織研磨器充分研磨，按1:5生理鹽水收集于離心管內，-70℃反復凍融三次，7000r/min，離心5分鐘，取上清液。
2．3 RNA提取：依照Omega公司RNA提取試劑盒的操作程序提取總RNA。
2．4 RT-PCR操作程序：依照TakaRa公司的一步法RNA PCR試劑盒操作程序進行。
擴增條件為：50℃，反轉錄30分鐘，94℃變性5分鐘，進入循環，94℃ 50秒，72℃ 60秒，40個循環后72℃延伸10分鐘。
3．RT-PCR產物檢測：擴增產物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外光下與標準分子量比較，如見585bp片段，初步診斷為陽性。

作者: luoyouyi 時間: 2009-6-23 22:28
檢測這搞體也不知道有沒有用，我檢測了好多次，但抗體高低不平，但也沒出問題。

作者: 姜寧 時間: 2009-6-23 22:38
謝謝，學習了。借此呼吁各位養豬人，為了你的輕松養豬，每年做兩次抗體檢測吧！

作者: xidaoli 時間: 2009-6-24 12:43
我們這邊的設備太不全。。也沒法測出來，看來得多弄點東西了。

作者: 362779682qqcom 時間: 2013-4-21 22:09
不錯哦，學習了

歡迎光臨畜牧人 (http://www.www12347.com/)

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