<strike id="imseu"></strike>

畜牧人

標題: 抗菌藥物敏感性試驗 [打印本頁]

作者: 曹志誠 時間: 2008-9-24 20:28
標題: 抗菌藥物敏感性試驗

抗菌藥物敏感性試驗

（一）藥敏試驗的目的
測定病原微生物對化學治療藥物敏感性的試驗稱為化療藥物敏感性試驗（Drug sensitivity test），簡稱藥敏試驗。藥敏試驗的主要目的是：①
用于測定新的抗菌藥物或制劑的抗菌譜；②
對病灶分離菌進行流行病學調查，主要應用于測定細菌經過多年后敏感性的變化情況和地區特異性；③ 在臨床治療感染性疾病時，針對病原菌選擇合適的首選藥物品種。
（二）藥敏試驗的原理及種類
藥敏試驗是通過培養基培養的細菌確定細菌對藥物的敏感性方法。將被檢菌接種在適當的培養基上，然后加上不同種類或不同濃度的抗菌藥物（或制劑），觀察細菌生長發育的速度和程度。用藥后，細菌在培養基上停止生長并且死亡，抑菌圈清晰，說明細菌對藥物敏感，藥物表現有較強的殺菌作用；用藥后，細菌停止生長，但液體培養基經過一定時間后還可能出現渾濁或固體培養基上的抑菌圈不清晰，說明細菌對藥物比較敏感，預示藥物對被檢細菌只是起抑菌作用。通常判定一種藥物對細菌的殺菌或抑菌作用的強度指標是固體培養基中抑菌圈的大小，但這也不是絕對的，因為抑菌圈的大小與藥物對培養基的滲透性是密切相關的。
藥敏試驗方法較多，但在原理上不外乎是稀釋法和擴散法兩大類。而擴散法（包括紙片法、管碟法）通常適用于臨床治療選擇藥物。
（三）常用培養基制作法
1．普通肉湯培養基
牛肉浸膏    3.0克
蛋白胨    10.0克
氯化鈉    5.0克
蒸餾水    1000毫升
放在三角燒瓶中，微溫溶解后，調節pH值至7.4~7.6，煮沸10分鐘，冷卻后的pH值為7.2±0.2。15磅壓力下滅菌15分鐘（115℃滅菌30分鐘）即得。
本培養基可用作為固體、鑒別、選擇等培養基制造的基礎原料，大部分細菌都能在其中生長。
1．普通肉湯瓊脂培養基
照上述普通肉湯培養基的配方及制法，加入15~20克瓊脂，加熱溶解后，調節pH值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，115℃滅菌30分鐘，即得。
3．0.5%葡萄糖肉湯培養基
蛋白胨    10克
氯化鈉    5克
葡萄糖    5克
牛肉浸膏    3克
蒸餾水    1000毫升
微溫溶解后，調節pH值至弱堿性，煮沸后，加葡萄糖溶解，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，115℃滅菌30分鐘，即得。
4．馬丁氏（Martin’s）肉湯培養基
      蛋白胨液       500毫升
      肉浸液          500毫升
      冰醋酸          1毫升
      醋酸鈉          6克
      葡萄糖          10克
   將蛋白胨與肉浸液混合，加熱至80℃，加冰醋酸1毫升，攪拌均勻，再煮沸5分鐘，加15%氫氧化鈉20毫升，調整pH至7.2。加醋酸鈉6克，再調整pH至7.2。繼續煮沸10 分鐘，用濾紙過濾，每1000毫升濾液加葡萄糖10克，分裝于500毫升三角燒瓶，高壓蒸汽滅菌（15磅）15 分鐘。
本培養基可用作傳染性胸膜肺炎病原體等的分離與培養。
5．革蘭氏陰性菌（G-N）增菌培養基
胰蛋白胨    20克       去氧膽酸鈉          0.5克
葡萄糖       1克       無水磷酸二氫鉀       4克
甘露醇       2克       無水磷酸氫二鉀       1.5克
枸櫞酸鈉    5克       氯化鈉                5克
                              水                1000毫升
將各組分加熱溶化，調整pH值至7.0，用濾紙過濾；分裝于18×100毫米小試管中，每管約1.5毫升，高壓蒸汽滅菌（15磅）15 分鐘，置冰箱備用。
用于糞便選擇性疾病桿菌，樣本接種后，最初6小時無論在室溫還是在37℃都有增菌作用。而在這一時期中，大腸桿菌和變形桿菌等生長很少，故在6小時后，再作用平板分離。
（四）臨床用藥選擇藥敏試驗法——擴散法（Diffusion method）
擴散法是在瓊脂培養基（多采用平板培養基）上接種被檢菌，將藥物（藥劑）配成一定濃度加在培養基上，培養一定時間后觀察接種菌是增殖還是抑制.這是測定藥物（藥劑）對被檢菌抗菌力強度的方法，本法可用于多種藥物（藥劑）對一種細菌的抗菌作用進行同時測定，有利于為臨床選擇藥物。
首先把可流動的固體培養基（加熱后的固體培養基）平鋪在平皿內冷卻使其凝固，在其表面上將菌液（被檢菌）均勻地涂抹開（也可將培養基溶解后在其凝固前將菌液與之稀釋制成雙碟，見后）。然后在其中以適當的間隔放置已知濃度的藥物（藥劑）（例如含有藥劑的紙片、片劑、濾紙、小鋼管等），藥液（藥物）向培養基內及其周圍滲透擴散。將上述的平皿放在一定的條件下（通常為37℃）的培養箱中培養一定時間（通常為16~24h）。以是否形成抑菌圈或抑菌帶及其抑菌圈大小來判定被檢菌對藥物的敏感性，測定藥物（藥劑）的抗菌強度。
1．敏感性圓片法（Sensitivity disc method）
本法所使用的圓片即含有一定量的抗菌藥物的干燥圓形濾紙（或片劑）。使用這些圓片檢查病料中細菌的敏感性的方法有間接法和直接法兩種。間接法是將膿汁、血清、糞便濾液等臨床材料在不含藥物的分離培養基中進行分離培養后，采取分離培養的典型菌落進行敏感性試驗。直接法是將病料直接涂抹在瓊脂培養基上，在其上放置含藥紙片進行培養觀察細菌對藥物的敏感性方法。在接種有病原菌的瓊脂培養基上，放置含有藥劑的紙片的地方，如果其藥物對病菌有抑制作用，則在其紙片的周圍會出現抑菌圈或抑菌帶，測量其抑菌圈（帶）的有無及其大小就可能判定菌株對藥物的敏感性。
直接法以非混合感染只含有某一種細菌的膿汁、血清、糞便濾液等作為被檢材料時，其優點是它比間接法能更快地得到結果，縮短藥敏試驗的時間。但若在被檢材料中除目的病原菌以外，還混有其他細菌則會給結果判定帶來困難。間接法雖然需要時間，但能從臨床病料中較準確地測定目的病原菌對藥物的敏感性。
（1）單一藥物濃度圓片法
即采用含有一種藥物濃度的圓片所進行的藥敏試驗法。其操作過程如下：
瓊脂平板用培養基制備  要求培養基中不含使藥物抗菌力降低的成分，而且應選擇對多種細菌都能生長發育良好的培養基（見普通肉湯培養基）。
平板的制備  將融化的瓊脂培養基約20毫升倒入內徑為85~90毫米的玻璃或塑料平皿中制成平板，操作應在水平的平面上進行，使培養基均勻水平地分布在平皿內（有要求血液的被檢菌時，如鏈球菌、肺炎球菌、白喉菌、巴氏桿菌等）應在普通肉湯瓊脂培養基中加5%的血液。瓊脂平板凝固后，在接種前應放在孵化器中30 分鐘使瓊脂表面水汽干燥。
菌量及接種法  被檢菌液，用滅菌生理鹽水等制備成5×108個/毫升的菌液，用1白金耳（約0.05毫升）在瓊脂培養基表面上接種，接種采用直徑為4~6毫米的滅菌玻璃球20個滾動使菌液均勻涂布在整個平皿瓊脂平板的表面（約使瓊脂表面的菌數為1~10×104/cm2）。
圓片的放置與培養  用滅菌鑷子輕輕地夾起含藥圓片，放置在培養基的表面，使圓片與瓊脂面緊密相貼，通常可在一個平板培養基上等間隔放置3~6個圓片，放置圓片后立即放到37℃的培養箱內培養（16~24小時，平皿應蓋上陶瓷蓋）。
結果判定
培養后，測定圓片周圍抑菌圈的直徑，將該藥劑對被檢菌敏感性的抑菌圈直徑與敏感標準的抑菌圈相比較，判定結果分為4級：最敏感（+++）；相當敏感（++），稍敏感（+）；耐藥（-）。另外，用本法，根據其抑菌圈的出現可求出最小抑菌濃度（MIC）。由于各種因素如培養基種類、平板培養基厚度、接種的菌量、藥物在培養基中的擴散能力、培養時間，均能影響試驗結果。因此測定時應盡可能將試驗條件保持一致，降低測定誤差。
（2）三種濃度圓片法
本法是采用一種藥物（藥劑）含有高、中、低3個等級藥物濃度的圓片組成的藥敏試驗法。操作過程與上述一種濃度法基本相同，但在判定時不需再測定抑菌圈直徑，因此，培養基的種類、培養基量、接種菌量對結果的判定影響不是十分明顯，且在一個平板上可放置3種（9片）紙片。
判定方法  根據含藥圓片周圍有無抑菌圈來確定其敏感性。具體地說，從圓片周邊算起有1毫米以上的抑菌圈時均為陽性，1毫米以下為陰性。高中低三種濃度圓片都有抑菌圈時為（+++）極敏感；僅中高濃度有抑菌圈時為較敏感（++）；僅高濃度有抑菌圈時為比較有耐藥性；高濃度圓片也無抑菌圈時為有耐藥性。

2．管碟法
（1）器械  瓊脂平皿、無菌吸管、無菌小鋼管（牛津杯）、無菌鑷子、無菌滴管、游標卡尺。
（2）分離并培養被檢菌種  將病料如膿汁、血液、糞便濾液、組織放在分離選擇培養基上培養，挑起典型目的菌落，增殖培養制取菌液并對被檢菌液進行細菌計數。
（3）雙碟制備  肉湯瓊脂培養基底層：將肉湯瓊脂培養基液化，取10毫升倒入滅菌玻璃平皿內，放在水平平面上，使培養基水平均勻地鋪在平皿內；肉湯瓊脂培養基菌層：吸取被檢菌液（106~108個/毫升）0.1~1毫升分別與100毫升冷至45—50℃的肉瓊脂培養基混勻，取5毫升均勻攤布在底層培養基上。即得雙碟。
（4）待雙碟中培養基凝固后，在每碟中均勻放置小鋼管（即牛津杯，內徑6.0±0.1毫米，高10.0±0.1毫米，外徑7.8±0.1毫米）4~6個，用陶瓦蓋復蓋。
（5）然后將不同種類不同濃度的藥液用無菌滴管加入小鋼管中（不同濃度的藥液以100微克/毫升為起點，用2倍稀釋法，使其藥液效價為100、50、25、12.5……0.025微克/毫升）。用蒸餾水作對照。
（6）置37℃恒溫箱中培養16~24小時，用游標卡尺量取抑菌圈的大小，判定其結果：
① 如果抑菌圈清晰，即表示為殺菌作用；
② 如果有抑菌圈，但不清晰，即表示為抑菌作用；
③ 在一定的范圍，抑菌圈的大小一般與藥物作用（抗菌）成正比例；
④ 如果抑菌圈比小鋼管（牛津杯）的外徑7.8毫米大1毫米，即表示有抑菌作用，因此可根據這一標準，通過試驗找出某一藥物對某一病菌的最小抑菌濃度（MIC）；
⑤ 如果沒有抑菌圈即表示耐藥。                         (操繼躍)

歡迎光臨畜牧人 (http://www.www12347.com/)

主站蜘蛛池模板：甘肃省| 女性| 凤冈县| 务川| 余姚市| 兴隆县| 台中市| 泸水县| 于都县| 上林县| 涡阳县| 建昌县| 无棣县| 苏州市| 乾安县| 武汉市| 资兴市| 台中县| 平江县| 云和县| 乐亭县| 宿松县| 共和县| 丹巴县| 拜泉县| 会同县| 云林县| 阜阳市| 建平县| 察哈| 滦平县| 衡山县| 论坛| 楚雄市| 凯里市| 小金县| 荣成市| 中超| 措勤县| 长岭县| 临洮县|