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畜牧人

關鍵詞：中和抗體；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；疫苗

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一種嚴重危害養豬業的傳染病［1］。該病于1987年在美國首次報道，1990年在德國也曾有報道，1990年-1991年冬季荷蘭和比利時發生本病，并擴散到英國，1992年侵入到法國。加拿大和希臘也有發病的報告,英國和美國稱它為豬“藍耳病”。通過空氣和豬的轉移是本病的主要流行方式，健康豬與病豬接觸、排泄物與分泌物污染的飼料等是本病傳播的主要途徑。臨床表現為母豬繁殖障礙，呈現流產、死胎、木乃伊胎及弱仔等癥狀，仔豬及育成豬表現為呼吸系統癥狀。根據臨床癥狀，基因和抗原性的不同，PRRSV可分為北美型和歐洲型分離株［2］。由于PRRSV具有抗原變異的特性，并且它的主要靶細胞是具有重要免疫作用的豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophage, PAM)，因此，PRRSV的感染常引發其他病原的繼發感染，尤其是呼吸道病原的感染，給養豬業造成重大經濟損失。目前，亞洲的日本、韓國、菲律賓等國也有該病的報道。1996年哈爾濱獸醫研究所在國內首次分離到PRRSV，證實本病在國內存在［3］。PRRSV屬動脈炎病毒科(Arteriviridae)，該科還包括鼠乳酸脫氫酶增高癥病毒(Lactate dehydrogenasee levating virus，LDV)、馬動脈炎病毒(Equine arteritis virus，EAV)、猴出血熱病毒(Simian hemorrhagic fever virus，SHFV)［4］。1992年OIE將PRRS列為Ｂ類動物疾病。該病毒粒子呈球形，直徑約為48 nm～83 nm，核衣殼直徑約為25 nm～30 nm，外繞脂質雙層膜，含一個球形立體對稱的、具有電子致密性的二十面體核衣殼；表面有明顯突起；用氯仿或乙醚等脂溶劑處理可滅活病毒，證明該病毒粒子存在囊膜。在氯化銫中浮密度為1.19，在蔗糖中為1.14；該病毒不能凝集哺乳動物，如豬、羊、牛、鼠、馬、兔、鴨、雞和人O型紅細胞；對熱不穩定，在4 ℃以上逐漸失去感染性，56 ℃經15 min～20 min失活［2］。

PRRSV一個顯著的生物學特性是對PAM的親嗜性，PAM是首選增殖系統。雖然呼吸道的上皮細胞也可被感染，但在肺臟病毒滴度可達105 TCID50/ｇ肺組織。盡管在脫落的肺泡樣細胞和支氣管上皮細胞也檢測到PRRSV，但PAM占肺臟受感染細胞的80%～94%[4]。PRRSV的另一個重要生物學特性是抗體依賴性增強作用(antibody dependent enhancement，ADE)。所謂ADE是指在一定抗體的存在下可介導和加強感染［4］。在豬肺泡PAM培養物中加入一定滴度的PRRSV抗體，可使PRRSV產量提高10倍～100倍。用加有PRRSV抗體的病毒培養物接種妊娠中期母豬，可提高病毒在胎兒中的復制，且顯著高于單純接種病毒組。反映在臨床上則是剛斷乳的仔豬呼吸道疾病臨床癥狀經常比較大的育成豬嚴重得多[5]。

1 感染免疫反應

有報道稱，豬人工感染后早期一段時間內，許多病例出現臨床癥狀和病毒在肺臟及其他組織的巨噬細胞中大量增殖的特征，然后出現組織高病毒含量和無細胞病毒血癥，可持續一個月以上[6]。在感染晚期，PRRSV在特定位點持續低水平存在，主要存在于淋巴組織。病毒持續感染包括不間斷的低水平的病毒復制，這個過程估計最少持續150 d[7-8]。大多數青年豬感染實驗表明，在病毒感染豬后2個月左右，是與其他動物接觸傳染最有效時期。盡管持續感染的真正機制還不清楚，但PRRSV之所以在恢復期動物體內持續存在，是因為宿主免疫體系不能建立有效的免疫保護作為主要致病因子的說法是合理的。因此，很多人認為免疫系統對豬抗PRRSV感染是無效的。豬感染PRRSV后約4周發生T細胞介導的反應，這種反應從感染后第9天到第14周[9]都可被檢測到。在接毒后早期能檢測到強抗體反應，開始于感染后7 d～9 d，這種血清反應可通過間接熒光抗體反應檢測到[10]。然而，沒有證據表明這種早期產生的抗體能夠保護豬不受PRRSV感染，這種早期產生的抗體在體外不能中和PRRSV[11]。具有中和活性的PRRSV抗體只出現在感染后期[12]早期明顯的PRRSV和抗PRRSV特異性抗體同時存在于循環體系中，說明早期產生的抗體沒有能力保護機體不受PRRSV感染。感染早期血清中存在的PRRSV抗體能刺激PRRSV在巨噬細胞中的復制，不論是在體內還是在體外[12],因而早期產生的抗體似乎無保護作用，相反可能是有害的。豬感染PRRSV也會發生針對病毒的遲發型超敏反應，說明CD4輔助性細胞也被活化。衡量T細胞毒性的IFN-γ也由T細胞產生[9]， CD4+ T細胞的目標是膜蛋白(M蛋白)和GP5(glycoprotein Ⅴ，GP5)，然而CD4+ T細胞的保護性反應和中和抗體的產生一樣，發生較晚。

2 中和抗體的作用

由于在用PRRSV攻毒后中和抗體的產生較慢而且不規則，所以中和抗體在保護機體免受PRRSV感染中所起的作用是有限的[13-14]。然而有報告指出中和抗體可以防止病毒血癥的發生；近年有人報道，病毒血癥的清除與抗GP5的抗體的出現密切相關[13-14]；另外，免疫接種GP5和M蛋白可提供一定程度的保護，這種保護與中和抗體的出現密切相關[15]。一個標準的評估中和抗體保護作用的實驗方法是在易感動物攻毒后人工被動輸入單克隆或多克隆抗體。一些病例中和抗體的出現削弱了機體抗特定病毒的免疫反應，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒和人免疫缺陷病毒[16]；在另一些病例中，被動免疫可提供堅強的保護作用。中和抗體的重要性已在其他動脈炎病毒感染中得到證實，例如馬動脈炎病毒感染，中和抗體調理起主要作用，可作為動脈炎病毒的樣本；另外，中和抗體在血清中的出現和病毒清除是同步的[17]；被動輸入中和抗體可降低EAV的復制并預防其感染。中和抗體主要是抗糖蛋白GL（GL是EAV的GP5中約含100個氨基酸的胞外結構域，EAV的主要中和表位在GL蛋白，定位在親水性胞外結構域N端1/2部分，約有99個～106個氨基酸）[15]。免疫接種重組基因疫苗(大腸桿菌中表達的GL蛋白的18位～122位氨基酸),發現中和抗體水平與對動物的保護力呈正相關，確證了中和抗體在保護動物抗EAV感染的重要性[18-19]。LDV是另一個被深入研究的動脈炎病毒，這個病毒可引起鼠的無癥狀感染，抗LDV中和抗體輸入小鼠體內可防止其感染LDV[20]。

許多報告指出中和抗體在抗PRRSV感染中起重要作用。有報告指出PRRSV自體滅活疫苗不能產生中和抗體，因而保護作用較弱；而弱毒疫苗可誘導產生抗體，因而有一定的保護作用[15]。盡管動物在感染PRRSV后或許細胞免疫和中和抗體在清除病毒過程中都起作用，但迄今為止證據只表明后者的重要性。另外，用PRRSV GP5接種免疫豬后可誘導產生中等水平的中和抗體，盡管如此，當用同種（或同源）毒株攻毒時，豬可被保護，僅表現輕微發熱，用MARC-145細胞只能從肺和縱膈淋巴結回收到病毒，攻毒2周后，中和抗體滴度增加到128[18-19]。因此，免疫接種PRRSV GP5的DNA疫苗和PRRSV弱毒疫苗都能誘導產生中和抗體，都有一定保護作用。最近有人進行了血清輸入實驗，提供了確鑿的證據證實單獨使用中和抗體可以完全防止PRRSV感染妊娠母豬；另外，無論是仔豬還是母豬，被動輸入的中和抗體可起消除性免疫的作用，可使感染豬用病毒分離法和RT-PCR法不能從淋巴器官檢測到病毒；同樣，中和抗體對幼豬也有保護作用，能夠100%保護易感動物抗PRRSV病毒血癥的最低抗體滴度是1∶8[10]。因此，無論是母豬還是仔豬，中和抗體在血清中的滴度與對豬抗PRRSV感染的免疫保護作用呈正相關。這些資料說明，通過被動輸入中和抗體的方法可為處于易感染PRRSV的動物提供及時保護。已有人用通過DNA重組技術克隆中和抗體基因獲得的高濃度的中和抗體被動輸入動物體，可作為治療方法[20]；也有人用PRSSV免疫接種母雞，然后從純化雞胚中的高滴度的中和抗體被動輸入動物體，使動物體處于中和抗體保護狀態，同時也可清除動物體內的病毒[21]。

3 中和位點

眾所周知，PRRSV的主要中和位點位于GP5蛋白[22-23]，另一個中和位點在M蛋白。GP5蛋白胞外結構域氨基端高度糖基化，并與M蛋白形成異原二聚體[22-23]，用反向免疫法和其他涉及重疊蛋白的研究確證GP5主要中和位點與中和抗體的活動相關，這個位點的最小抗原區域在33位～47位氨基酸，已被確認是中和表位的核心區域[24]。這個核心區域被稱做B位點，B位點可被單克隆抗體所識別，并且可誘導產生我們已用于上述被動免疫試驗的抗體[25]。另外，Wissink E證實中和單克隆抗體可識別歐洲株的胞外域N端,Plagma P用恢復期動物血清發現，中和位點在歐洲株和美洲株都存在。兩種病毒中和位點定位與上述B位點定位相同，所有結果證實GP5胞外域對PRRSV起重要的生物學作用。

GP5的另一個顯性表位被稱作A位點。在PRRSV感染后表位A迅速誘導非中和抗體產生。A位點的核心部分在GP5蛋白的第7位氨基酸，在B位點上游，GP5的氨基端[24]。它的特征與Decoy表位功能相似。Decoy位點是那些導致與中和位點免疫反應性降低的毗鄰于中和位點的位點，例如,在人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的GP41蛋白[25]。HIV的糖蛋白41(GP41)蛋白的中和位點（ERDRD 位點）對兔有免疫原性，然而當位點ERDRD多肽與非中和位點(IEEE位點)并列存在時， ERDRD位點對兔的免疫原性消失了。無中和活性的IEEE位點與位點ERDRD相距約兩個氨基酸，因此，可推測是非中和位點降低了中和位點的免疫原性。用含位點ERERD而無IEEE位點多肽免疫接種小鼠，可使獲得的血清中抗ERDRD位點的抗體濃度在0.1 μg/mL~0.2 μg/mL[26]。

已被深入研究的LDV的中和位點位于VP-3P(LDV的主要糖蛋白)的37位~44位氨基酸之間，這是LDV惟一的中和位點，代表VP-3P的合成多肽可被中和單克隆抗體識別，這個合成多肽可用于ELISA檢測血清中的中和抗體[16]。然而，針對這段多肽的抗體不能中和LDV，說明這段多肽不是最優化構象[22]。與PRRSV的GP5表位相似的多肽通過半光氨酸定位于碳端，作為人造多肽用于免疫接種小鼠或豬，盡管動物能產生針對這段多肽的抗體，但所產生的抗體不能中和PRRSV[12]。因此，和LDV一樣，PRRSV的中和位點確實能被中和抗體所識別，但不能誘導中和抗體的產生，提示還有其他殘基對誘導中和抗體產生起決定作用。

中和位點的突變被稱作抗原漂移，是RNA病毒免疫逃逸的主要機制。然而，有的病例中和位點定位于具有強致病力的糖蛋白，這些病例中，突變發生在這些特殊位點對病毒不利，PRRSV正是如此。因此，其他非常規的感染機制對PRRSV逃避免疫監視并在宿主體內持續存在起重要作用。抗位點A的抗體在PRRSV感染早期被誘導產生，而在感染后前30 d不能檢測到抗B位點的抗體[27-28]。因此，認為A位點與中和B位點的同時出現將抑制對中和位點B的反應。抗中和位點B的抗體的延遲產生可以解釋早期研究者所描述的無中和抗體產生的原因，因此，中和抗體延緩產生是PRRSV逃逸免疫監視的主要機制，也是PRRSV感染的主要特征。很多研究表明GP5前導區存在斷裂位點，用不同的預測方法，一些研究者推定GP5前導區斷裂位點在31位~32位氨基酸之間[27-28]，而另一些研究者認為在25位~26位氨基酸之間[20]。因此，有人推定很可能在感染后期PRRSV的變異是由糖基化和非常規的GP5多肽的斷裂引起的，由于在31位~32位氨基酸斷裂造成無位點A，PRRSV含這種類型的分子形式會誘導低水平的抗位點B的免疫反應。因此，在持續感染階段所產生的抗體對清除病毒是無效的，當PRRSV發生突變，致使A位點消失，B位點被識別，誘導中和抗體產生，并最終清除病毒。例如，據最新報道，親神經性PRRSV毒株在GP5的44位氨基酸有N-S突變，這將缺失這個位置的糖基化。這個突變與LDV的N-S突變相似，使這個毒株有親神經性同時使其更易被中和。

在PRRSV攻毒后發生急性冗長的感染，以病毒血癥為特征，大約持續30 d，此期間無抗B位點的中和抗體產生，PRRSV開始以非常規的機制逃避免疫監視。例如，在感染后誘導低水平的α-IFN以降低危險信號（一般能誘導強烈特異性細胞反應）水平[9]，誘導多克隆擴張，以分散特異性抗體反應。另外，在攻毒感染后數周，抗GP5蛋白胞外域抗體處于免疫顯性的核心位置，而不是A位點，很可能是A位點與胞外域的糖基化抑制了B淋巴細胞特異位點上的IgM識別B位點。當PRRSV發生抗原位點突變，A位點消失，誘導中和抗體產生。中和抗體和細胞免疫反應共同作用終止病毒感染細胞，并最終根除組織中的病毒。

4 展望

中和抗體在抗PRRSV感染過程中起重要作用，然而延遲誘導保護性細胞免疫和體液免疫,為病毒在宿主體內大量復制，并感染其他易感動物提供了一個時間窗口。在這個過程的晚期，中和抗體和細胞免疫同時被誘導，終止病毒感染細胞，并最終根除組織中的病毒。血清中和抗體水平與B位點特異性B淋巴細胞的克隆頻率的增長正相關，再次感染PRRSV將活化這種克隆，并會誘導得更快、產生更多的中和抗體，這已在免疫接種動物攻毒試驗中被證實。因此，理想的PRRS疫苗應該在短時間誘導高水平的中和抗體和特異性細胞免疫反應。

作者：宋志軍等 文章來源：動物醫學研究進展