病原分離是最準確的診斷方法，但是缺點是確診時間長。由于豬流感病毒對外界的抵抗力很弱，因此對具有呼吸道癥狀豬進行病毒采集，并迅速進行分離，是病毒分離的關鍵。從活體內分離病毒可采用鼻粘膜拭子法。采集的拭子放在適當?shù)倪\輸培養(yǎng)基如生理鹽水、PBS、MEM中盡快送往實驗室。病死豬則采集病變的上呼吸道和肺組織。樣品經常規(guī)無菌處理后接種雞胚或敏感細胞, 于33～35 ℃孵育48～72h后,收集尿囊液或細胞培養(yǎng)液進行HA試驗以證明是否有流感病毒的存在。若初代分離物無HA活性,則再盲傳兩代。用HI試驗和神經氨基酸酶抑制NI試驗可確定分離到的流感病毒的血凝素及神經氨基酸酶亞型。