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| 川楝素妊娠毒性作用與孕鼠INF-γ、TNF-α含量的相關性研究 |
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張建樓 鐘秀會 史萬玉 馬愛團 (河北農業大學動物科技學院，河北保定071001) 長期以來，農藥殘留對于公眾健康的危害是以引起癌變作為指標。近年來由于農藥殘留對生殖和發育危害的后果突出，被認為可能是造成不孕、流產、功能異常和畸形等因素之一。有研究表明動物生殖和胚胎發育過程對農藥毒物似乎更加敏感。因此，農藥對生殖和發育的危害及其后果的分析成為生殖和發育毒物學中重要的研究內容，并逐漸進入各國的食品常規分析和檢測項目中。川楝素(Toosendain)是從傳統驅蛔中藥楝屬植物川楝樹或苦楝樹的根皮苦楝（Melia azedarach L）皮、川楝（Melia Toosendain Sieb.et Zucc）子中提取的一種四環三萜類化合物[1,2]。最早于1953年由四川省中藥研究所提取，主要用來驅蟲，近年來也用于農業殺蟲[3]。關于楝樹的殺蟲作用，歷史上有不少記載，《神農本草經》中記有楝樹“殺三蟲”。蘇東坡所著《格物粗談》中記載，“收苦楝花或葉藏席下可避蚤虱”，“端午取楝子碎投廁中不生蟲”。已有研究表明，一定劑量的川楝素能使小鼠完全流產[4]?，F在川楝素多用于蔬菜、瓜果的殺蟲，其在蔬菜、瓜果上殘留的是否對人類尤其是孕婦有潛在的影響呢？研究川楝素對動物的生殖毒性作用和機理，以及劑量和效應關系，對于豐富中藥藥理學內容，保證川楝素作為農業殺蟲劑的安全使用，有著重要的意義。 1 材料和方法 1.1試驗動物 10周齡未經產純種BALB/c系小鼠（清潔級），購自河北醫科大學。常規飼養，自由采食。日光照12h。經適應環境1周后，眼觀檢查結合陰道涂片法進行發情鑒定。陰道涂片經姬姆薩染色，鏡下觀察全部為無核角化上皮細胞定位發情。發情母鼠與公鼠1：1合籠過夜，于次日清晨，見有陰栓者定位孕0d。 1.2試驗藥品及配制 川楝素提取物（含量90%），購自深圳市倬源實業發展有限公司，用10%丙二醇生理鹽水（經細菌濾器過濾消毒）稀釋成20μg/mL。 小鼠TNF-α、INF-γ ELISA試劑盒，R＆D Systems明尼阿波利斯，明尼蘇達州，美國，購自晶美生物公司。 1.3試驗動物分組與處理 試驗分5組。經預試驗發現，腹腔注射10%丙二醇生理鹽水對孕鼠的妊娠沒有影響。A組在孕5、6、7d時腹腔注射10%丙二醇生理鹽水。川楝素對小鼠的腹腔注射LD50是13.8mg/kg[4]，B、C、D、E組孕鼠在孕5、6、7d時分別腹腔注射川楝素溶液1/60 LD50、1/30 LD50、1/20 LD50、1/15 LD50。注射前用天平稱取每只小鼠的體重，計算注射劑量。于孕8d眼球采血處死小鼠，取上清，用于測定血液中細胞因子的含量；取右側子宮勻漿，測定細胞因子的含量。 1.4流產判定及胚胎吸收率、流產率的計算 胚胎體積變小、顏色紫黑、出血壞死、呈血團狀、鏡檢無胎膜結構為胚胎吸收或死亡。胚胎個體大，粉紅色，鏡檢胎膜及胎兒輪廓清晰，無出血、淤血者為正常胚胎。按下列公式[5]計算試驗各組的流產率和胚胎吸收率。 流產率=發生流產的母鼠數/試驗組母鼠總數×100% 胚胎死亡（吸收）率=死亡胚胎數/（死亡胚胎數+正常胚胎數）×100% 1.5TNF-α、INF-γ的測定 眼球采血，12000r/m，4℃離心10min,取上清液分裝備用。取右側子宮，剪除子宮系膜及脂肪，縱向切開子宮，剝去胎兒，剪碎子宮角，加入6倍于子宮質量的含有PMSF（蛋白酶抑制劑0.75μg/mL）的PBS（pH7.4）。在冰水環境中立即進行勻漿，12000r/m, 4℃，離心15min，取上清液分裝，-80℃凍存待檢。TNF-α、INF-γ的測定均按試劑盒說明操作。加終止液后即刻在318MC型酶標分析儀(上海三科儀器有限公司)450nm處讀取OD值，利用已知濃度的標準樣品OD值繪制標準曲線，據此標準曲線計算各細胞因子含量。 1.6統計方法 使用Excel 2000和SPASS12軟件包,以單變量方差分析和卡方檢驗進行統計，數據以均值±標準差()表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。 2 結果 2.1川楝素溶液致早期孕鼠流產的效果 對照組A組本身有一定的自然流產率14.29%，胚胎吸收率13.04%；B組流產率50.00%，與A組相比較，流產率差異不顯著（P>0.05），胚胎吸收率為42.59%，與A組比較差異極顯著（P<0.01）；C組流產率為 62.5%，與A組比較差異顯著（P<0.05），胚胎吸收率為46.55%，與A組比較差異極顯著（P<0.01）；D組流產率為 75.00%，與A組比較差異顯著（P<0.05），胚胎吸收率為70.37%，與A組比較差異極顯著（P<0.01）；E組流產率為 89.89%，與A組比較差異極顯著（P<0.01），胚胎吸收率為73.77%，與A組比較差異極顯著（P<0.01）。胚胎吸收率B組與D、E組比較差異極顯著P<0.01）；C組與D組比較差異顯著（P<0.05），與E組比較差異極顯著（P<0.01）；D、E組間差異不顯著（P>0.05）。B、C、D、E各組之間流產率差異不顯著（P>0.05）。詳見表1。 表1 不同劑量川楝素的流產效果 組別 roup 流產率(%) Abortion rate(%) 胚胎吸收比率(%) Rate of embryo resorption(%) A對照組 14.29%(1/7) cdE 13.04%(6/46)BCDE B組 1/60LD50川楝素注射液 50.00%(4/8) 42.59%(23/54)ADE C組1/30LD50川楝素注射液 62.50%(5/8)a 46.55%(17/58)AdE D組1/20LD50川楝素注射液 75.00%(6/8)a 70.37%(38/54)ABc E組1/15LD50川楝素注射液 88.89%(8/9)A 73.33%(44/60)ABC 注：小寫字母不同表示差異顯著（P<0.05）,大寫字母不同表示差異極顯著（P<0.01），以下同。 2.2血清和子宮組織中TNF-α測定結果 川楝素可以提高血清和子宮組織中TNF-α的含量。B組注射1/60 LD50的川楝素溶液，TNF-α在子宮組中含量為1893.378±61.236pg/g蛋白，顯著高于對照組A組（P<0.05），在血清中含量為31.938±9.827 pg/mL，顯著高于對照組A組（P<0.05）；C組注射1/30 LD50的川楝素溶液， INF-γ在子宮組織中含量為2263.128±281.934pg/g蛋白，極顯著高于對照組A組（P<0.01），血清中含量為55.979±29.753 pg/mL，極顯著高于對照組A組（P<0.01）；D組注射1/20 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮中的含量為2008.374±175.374pg/g蛋白，極顯著高于對照組A組（P<0.01），血清中含量為43.438±14.965 pg/mL，極顯著高于對照組A組（P<0.01）；E組注射1/15 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮中的含量為1997.436±271.146pg/g蛋白，極顯著高于對照組A組（P<0.01），血清中含量為32.688±11.264 pg/mL，顯著高于對照組A組（P<0.05）。子宮組織中INF-γ含量C組與B組比較差異顯著（P<0.05），血清中的INF-γ含量C組與B組、E組比較差異顯著（P<0.05）。詳見表2。 表2 各處理組血清和子宮組織中TNF-α的含量 組別 Group 血清(pg/mL) Blood sperum (pg/mL) 子宮組織（pg/g） Uterus tissue (pg/g) A對照組 3.729±0.144bCDe 1439.628±163.074bCDE B組1/60LD50川楝素注射液 31.938±9.827ad 1893.378±61.236ac C組1/30LD50川楝素注射液 55.979±29.753Abe 2263.128±281.934Ab D組1/20LD50川楝素注射液 43.438±14.965A 2008.374±175.374A E組1/15LD50川楝素注射液 32.688±11.264ad 1997.436±271.146 A 2.3血清和子宮組織中INF-γ測定結果 川楝素可以提高血清和子宮組織中INF-γ的含量。B組注射1/60 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮組中含量為3724.998±421.212pg/g蛋白，顯著高于對照組A組（P<0.05），在血清中含量為42.656±15.118pg/ pg/mL，極顯著高于對照組A組（P<0.01）；C組注射1/30 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮組織中含量為4182.402±608.154pg/g蛋白，極顯著高于對照組A組（P<0.01），血清中含量為56.250±22.991 pg/mL，極顯著高于對照組A組（P<0.01）；D組注射1/20 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮中的含量為3805.002±243.864pg/g蛋白，顯著高于對照組A組（P<0.05），血清中含量為37.813±10.7892 pg/mL，顯著高于對照組A組（P<0.05）；E組注射1/15 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮中的含量為3633.600±374.568pg/g蛋白，顯著高于對照組A組（P<0.05），血清中含量為34.219±8.646 pg/mL，極顯著高于對照組A組（P<0.01）。INF-γ在子宮組織中的含量各實驗組之間差異不顯著（P>0.05）；血清中的INF-γ含量C組與B組比較差異不顯著（P>0.05），與D組相比較差異顯著（P<0.05），與E組比較差異極顯著（P<0.01）。詳見表3。 表3 各處理組血清和子宮組織中INF-γ的含量 組別 Group 血清(pg/mL) Blood sperum (pg/mL) 子宮組織（pg/g） Uterus tissue (pg/g) A對照組 6.000±0.354BCde 2743.998±169.704bCde B組1/60LD50川楝素注射液 42.656±15.118A 3724.998±421.212a C組1/30LD50川楝素注射液 56.250±22.991AdE 4182.402±608.154A D組1/20LD50川楝素注射液 37.813±10.7892ac 3805.002±243.864a E組1/15LD50川楝素注射液 34.219±8.646aC 3633.600±374.568a 3.討論 孕8d剖檢，1/30LD50的劑量使孕鼠達到62.5%的流產率，與對照組比較差異顯著。1/20LD50、1/15LD50川楝素溶液由于導致75%、88.89%流產，因此劑量偏大，不適合做流產模型；而1/60LD50的流產率又偏小，1/30LD50的劑量使流產率達到62.5%，又有一定的成活的胚胎，與對照組比較顯著差異（詳見表1）。因此，1/30LD50的川楝素溶液流產效果比較理想，所以選擇1/30LD50為川楝素致流產的最佳劑量。 川楝素本身有一定的毒性。腹腔注射大劑量川楝素可引起急性中毒，主要致死原因是由于血管壁通透性增加，引起內臟出血，血壓下降而形成急性循環衰竭。張先福研究表明[4]，給妊娠早期母鼠腹腔注射最大劑量不到1/10的LD50（13.8mg/kg）川楝素，就會使胚胎異常，產生毒性作用。本研究給孕5d的小鼠連續3d腹腔注射川楝素溶液，通過解剖發現，具有子宮出血、子宮水腫，胚胎死亡的孕鼠數量顯著高于對照組（P<0.05）說明川楝素的致流產作用明顯，與前人的工作是相吻合的。由本研究結果可以看出，給孕5d的小鼠注射川楝素溶液后，TNF-α、IFN-γ的含量顯著增加，說明川楝素可以促進Th1細胞因子TNF-α、IFN-γ的分泌。 本試驗結果表明，孕5d小鼠注射不同劑量的川楝素溶液后，在導致流產的同時TNF-α、IFN-γ的含量升高。TNF-α和IFN-γ都屬于Th1型細胞因子。近年來，普遍認為早期胚胎丟失與子宮免疫環境有密切關系，提出白介素-2（Interferon-2,IL-2）、腫瘤壞死因子（Tumour necrosis factor,TNF）,以及γ-干擾素（Interferon-γ）等可導致胚胎死亡[6]。 TNF-α主要由Th1細胞分泌，活化NK細胞和肥大細胞也分泌一部分[7]。TNF-α導致流產已被動物試驗所證實。Gendron等報道，LPS誘導小鼠流產與子宮內的TNF-α增多有直接關系[8]。將人工重組TNF-α直接注入孕鼠體內，亦可引起流產[9]。同時，TNF-α能抑制滋養層細胞DNA合成及增生。TNF-α為重要的炎癥介質和免疫調節因子，是造成胎盤壞死的終末介導物之一。 TNF-α對生殖過程有重要影響[10,11 ],在小鼠的懷孕期被嚴格地控制著[12] 。TNF-α異常對妊娠時胚胎存活是有害的[13]，母體TNF-α可能影響囊胚生長和著床[14,15] TNF-α在黃體形成期起著重要的調節作用，抑制胚泡著床[16]。TNF-α能誘導滋養層細胞凋亡，促進胎盤血管血栓形成，誘發宮縮使著床的胚胎壞死、排出。TNF-α與IL-2共同作用還可使NK細胞活化，損害胎盤組織。TNF-α參與抗體依賴細胞毒作用，并使前列腺素增多導致流產[17]。但是大量資料表明，正常妊娠期間適量TNF-α能促進分解代謝，從而滿足胎兒的營養需要，對其他細胞因子及黏附分子的表達具有一定的調節作用，在維持正常妊娠的順利進行中必不可少，參與了妊娠期間免疫平衡的建立和穩定[18]。 IFN-γ主要來自活化的T細胞、NK細胞、胎盤滋養層細胞及絨毛間質霍夫包爾氏細胞， IFN-γ通過誘導單核巨噬細胞的主要組織相容性復合體（MHC）-Ⅱ類抗原表達，參與抗原遞呈和特異性免疫識別過程[19]。原因不明習慣性流產患者血清中平均IFN-γ含量明顯高于正常對照組（P﹤0.05）[20]。試驗證明，一定濃度范圍的IFN-γ（10~1000ng/mL）可明顯抑制絨毛膜滋養層細胞活性及其hCG分泌，其抑制作用呈劑量依賴性[21]。IFN-γ/IL-4可能通過影響胎盤滋養層細胞活性及hCG分泌而在早期妊娠中起重要的免疫調節作用[22]。由此可以說明，IFN-γ濃度的升高伴隨著hCG分泌量得降低，從而不利于妊娠的進行。曹永清等人發現人重組IFN-γ對人子宮蛻膜組織蛋白的合成呈抑制作用，給孕兔注射導致胚泡著床率降低80%左右。IFN-γ能夠活化Mφ,使其具有抗原遞呈能力，此種作用可以被IL-10抑制[23]。體外試驗證明，IFN-γ抑制滋養層的生長，IFN-γ與INF-α協同作用可抑制胚胎的生長發育，上調胚胎MHC-I類抗原的表達，IL-2誘導蛻膜NK樣細胞增殖并使其轉化為具有殺傷滋養層細胞的表型。Th1型細胞因子可能通過激活NK細胞與LAK細胞而作用于胎兒胎盤組織，導致妊娠失敗[24]。白血病抑制因子（LIF）和IFN-γ都是由母胎界面的細胞和組織所分泌，LIF促進胚胎的著床有利于妊娠的進行，IFN-γ卻不利于妊娠[25]。 本試驗結果表明，苦楝皮及其單體成分川楝素能導致孕鼠流產，使子宮內Th1型細胞因子IFN-γ、TNF-α含量升高，從而打破了母胎界面Th1/Th2的平衡，導致流產的發生。 參考文獻 [1].Patrick J,Lindstrom JM. 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