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    標題: 嘌呤法測定瘤胃微生物蛋白 [打印本頁]

    作者: huig5182005    時間: 2007-8-29 10:23
    標題: 嘌呤法測定瘤胃微生物蛋白
    瘤胃微生物蛋白質產量的測定

    嘌呤法

    一、操作方法樣本的嘌呤分析

    1、準確稱取0.5克充分干燥(用凍干機干燥)的食糜樣本,或分離所得的食糜微生物部分樣本,置于25ml具塞帶刻度的試管內。注意:樣本必須是干燥的,否則會導致核酸水解不完全。

    2、加入2.5ml高氯酸(Hclo4,70%),緊蓋瓶口,然后將其放在90~95℃的恒溫水浴內培養1小時。此時樣本即炭化,形成黑色硬結。最好是將硬結破碎,以利反應完全。

    3、再加入17.5ml乙種PH緩沖液(NH4H2PO4,0.0285M),充分搖動,緊蓋瓶口,重新置于90~95℃的恒溫水浴內培養10~15分鐘,然后通過Whatman 4號濾紙過濾,此時濾液的PH值為2左右。

    4、取0.5ml濾液轉移到容積為15ml的離心管內。分別加入0.5ml AgNO3(0.4M)和9ml甲種PH緩沖液(NH4H2PO4,0.2M)。然后置于暗處至少30分鐘。最好是將其放置過夜(5℃),可提高分析的準確度。

    5、于4000rpm離心15分鐘,然后小心地棄去上清液。注意不要攪動瓶底的沉淀物。

    6、用PH為2的蒸餾水洗離心分離所得沉淀物一次。用與第5步同樣的方法離心,棄去上清液。

    7、加入10ml 0.5N的鹽酸溶液,充分搖動,使其與沉淀物混勻為止。

    8、用具塞密封離心管,放在90~95℃的恒溫水浴內培養30分鐘。

    9、用紫外分光光度計于260nm處比色,測得的嘌呤濃度用RNA當量表示。

    酵母RNA(中國科學院上海生物化學研究所)

    標準曲線的制定:準確稱取0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.4,0.50克酵母RNA,分別置于8個25ml的具塞帶刻度的試管內,按上述分析樣本內嘌呤含量的操作方法進行處理,最后于260nm處比色。





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