畜牧人
標題: 豬偽狂犬病診斷方法研究進展 [打印本頁]
作者: kinki0396 時間: 2007-7-13 10:36
標題: 豬偽狂犬病診斷方法研究進展
偽狂犬病(Pseudorabies，PR)由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起，最早發現于美國，因臨床表現與狂犬病類似，故稱偽狂犬病。該病在全球范圍內的流行呈上升趨勢，世界上已有50多個國家和地區報導該病的流行。我國自1947年劉永純從豬體分離到PRV以來，已有24個省(市)、自治區報導流行[1]。文章主要對血清學、分子生物學診斷與檢測方法以及鑒別診斷方法進行綜述。
成年豬無明顯癥狀，母豬流產或產死胎，仔豬表現神經癥狀，肌肉振顫，嚴重時四肢劃水樣運動，體溫升高達41 ℃～42 ℃。取PR病例的腦和脊髓做成組織切片，蘇木素-伊紅染色后觀察呈現非化膿性腦炎變化，其他大體剖檢特征不明顯。在神經細胞、膠質細胞和毛細血管內皮細胞可檢出A型核內包涵體。
將典型病例病料懸液給家兔、小鼠或雞胚接種，觀察其臨床癥狀的出現從而確診。家兔出現精神委頓，體溫升高，繼而注射部位出現奇癢癥狀，隨即肌肉痙攣，角弓反張，最后死亡。小鼠接種后有奇癢癥狀，持續12 h，在2 d～5 d內死亡。雞胚接種后3 d～4 d后，病毒侵害神經系統，雞胚死亡[2]。
中和試驗(serum neutralization test，SN)又稱微量血清中和試驗(mircoserum neutralization test，MSNT)，作為病毒檢測的經典方法，是世界上多數國家檢測PR的法定方法之一[3]。
方六榮等[4]用MSNT進行了PR的血清學調查。通過監測中和指數和中和效價，發現SNT的特異性很強，但敏感性較低。如果延長抗原與血清的孵育時間，尤以補體存在時，可使其敏感性增高。由于該法操作繁瑣，工作量大，且受技術、細胞等條件限制，給實際應用帶來一定的困難。
乳膠凝集試驗(latex agglutination test，LAT)利用抗原抗體特異性結合的性質，先用乳膠包被抗原，再與相應血清反應，如幾分鐘內發生凝集，可判定有PRV感染。日本的柴因勛對比了LAT和SNT，檢驗了1 659份血清樣品，發現LAT和SNT的相符程度達97.6%。且由于LAT可以檢測有很強凝集活性的IgM，可以早于SNT檢測到PR病毒的抗體。國內吳斌等(1997)做了同類試驗也表明LAT和SNT間無統計上的差異。美國已經有商品化的LAT試劑盒供臨床使用[5]，華中農大也于國內率先研制成功LAT試劑盒。LAT操作簡單、方便、快速，且敏感性、特異性強，適用于疫病監測或流行病學調查，以及種豬群檢疫凈化陽性豬初次篩選。與SNT相比，LAT具有更加廣闊的推廣前景[6]。
Stewart等(1967)首先應用熒光抗體染色法(immunofluorescence，IF)檢查分別以病毒和病料接種的PK-15細胞培養物，獲良好結果。用免疫熒光技術對采自不同組織的病料進行檢測發現，扁桃體和淋巴結的檢出率最高，其次是大腦、脾和脊髓。黃駿明等(1995)報導建立了檢出率在95%以上的直接免疫熒光試驗。取病豬的腦三叉神經、延腦和脊髓等組織作冰凍切片后免疫熒光檢查，可于2 h～ 4 h內得到結果。此法是我國目前用于PR快速診斷的一種較好的方法。
酶聯免疫吸附試驗(enzyme-Iinked immunosorbent assay，ELISA) 具有快速、簡便的優點，IgM-ELISA還可早期檢測[7]。OIE將其作為診斷豬PR的首選血清學方法。美國也將ELISA作為3種PR的法定檢測方法之一。
用ELISA檢測PRV抗體的方法由Snyder等(1978)首創。Homme P等 (1997)將PRV gD基因在桿狀病毒中表達，制成重組抗原并建立了競爭ELISA(cELISA)。用此法可檢測到感染2周后血清陽轉的情況。Gut M等[8]用同樣載體表達了gE糖蛋白和gI糖蛋白，構建了直接競爭ELISA(gE/gI -ELISA)，試驗證明gE/gI ELISA比gE-ELISA的敏感性和特異性更強，還可用于檢測感染2周齡的早期感染豬血清中的抗體。
婁高明等(1998)建立了檢測PRV抗原的雙抗體夾心ELISA法，因其操作簡便，不需要昂貴的儀器，因此適合大規模的檢驗檢疫。四川農業大學的曹三杰等[9]建立了Dot-PPA-ELISA，可檢測最低IgG含量為1.398×10－8g。中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所研制的Dot-ELISA試劑盒已投入使用[10]。
1977年Gutekunst D E等首次報道了利用微量免疫擴散試驗(microimmunodiffusion test，MIDT)檢測了2 200多頭豬血清中的PRV抗體，其陽性結果與SNT相同[11]。此法所得結果不受血清污染、溶血和細胞毒素等條件的影響，具備經濟和操作簡便、重復性好、特異的優點，但敏感性不高。Willam P(1994)分別對MIDT、SNT、對流免疫電泳(countercurrent immunoelectrophoresis，CIE)進行了比較，3種方法的檢測結果也很接近。國內的黃生(1989)、吳斌(1997)在做了同類的比較試驗后認為MIDT操作簡單，結果準確，適合基層和大型豬場使用。
Tetsu N等(1989)發現PRV可以凝集Balb/c小鼠紅細胞，并以此建立了PRV的血凝試驗與血凝抑制試驗(hemagglutination or HA-inhibition，HA或HI)，檢查豬血清抗體的結果與SNT緊密相關，但是HI效價較低。Inaba Y將抗原與血清孵育時間延至48 h，再加補體繼續孵育1 h，效價比前法高2倍～32倍。但是，Yamada S等研究發現gC-PrV 突變株不能凝集紅細胞。吳平等(1991)用單克隆抗體致敏綿羊紅細胞，建立了反向間接血凝抑制試驗，SNT符合率為94%。
Narita等(1982) 建立了免疫組化技術檢測組織中重激活的PRV。Ducatelle等(1982)用免疫過氧化物酶技術檢測了61頭有神經癥狀的病豬，發現與病毒分離試驗試驗相符程度為95%。Afsher等(1986) 建立了可對PRV進行定量分析的免疫過氧化物酶蝕斑染色方法[12]。
除以上方法外，還有補體結合試驗、皮膚變態反應試驗、放射免疫試驗[13]和對流免疫電泳等試驗可用于PR的診斷。
核酸探針又稱核酸雜交(ribonucleotide hybridization)，具有高特異性、高敏感性的特點，已被用于PR的診斷。Brown T M等(1988)建立了檢測感染豬體內PRV-DNA的原位雜交法[14]。Linne T(1987)報道的斑點雜交法中，用P32標記的探針在感染后4 h就可檢出組織中的病毒DNA，而分離病毒需要1 d～2 d。Maes R K等[15]用生物素和地高辛標記探針，其敏感度為1 pg～5 pg。郭萬柱 (1991)等也用全基因組和重組質粒制備了P32標記的探針，成功的檢測了10 pg的PRV DNA。李學伍等(1997)利用PCR(polymerase chain reaction，PCR) 特異性擴增產物制備地辛高標記的探針，對閩A株、鄂A株、Baratna株、英國株及臨床病料進行檢測，結果與PCR檢測結果相符，準確率為100%，靈敏度達到2 pg DNA。在沒有PCR技術之前，核酸原位雜交技術是短時間檢查PRV潛伏感染的最敏感的方法。
Belak S等(1989)率先建立了PCR檢測PRV的方法。Jestin A等(1990)由鼻拭子抽提核酸，擴增gD基因序列而檢測到PRV。李學伍等(1998)研究發現，PCR的敏感性顯著高于MSNT，PRV檢出率最高的組織為三叉神經節(100%)。Galeota-wheeler等通過合成擴增gD基因的引物，從豬的扁佻體、三叉神經節、嗅球和腦干中檢測出了潛伏感染的PRV DNA。Talmage T B等[16]應用來自gB(g)基因的寡核苷酸引物對活檢的扁桃體細胞或實質組織進行擴增，可檢查潛伏感染。其還通過應用來自gB 基因的嵌套引物對PRV DNA 進行扁桃體細胞內擴增并應用原位雜交來探查細胞內擴增的DNA，大大提高了檢出率。Cheung A K[17]也通過PCR在14頭豬中檢出三叉神經節(100%)和扁桃體(86%)中的潛伏感染。PCR敏感性高，特異性好，費時少，可作為活體檢查用。
目前，PR防控中使用了大量的疫苗，以上的檢測方法無法區分疫苗毒和野毒的感染，要區分疫苗接種動物和野毒感染動物，就需要以下的鑒別診斷方法。
Lomniczi B等(1984)對Bartha和Norden等疫苗毒株及Ka等野毒株DNA用BamHⅠ，Bgl和Kpn酶切分析，發現弱毒株在US區有缺失。Gielkens A L J等(1985)NIA-3等野毒株和Bartha，BUK，Ercegovac，B-KAL和MK-25 5個弱毒疫苗株DNA以BamHⅠ酶切分析也證實疫苗株在US區缺失，導致酶切圖譜改變。此法可用于流行病學調查。
根據疫苗株所缺失的糖蛋白可將鑒別ELISA分為gE-ELISA、gC-ELISA和gG-ELISA。其中gE-ELISA敏感性最高，應用較多，最早由荷蘭的Van Oirschot J T等(1986)建立，其敏感性好于SNT。Morenkov O S等[18]建立了兩種檢測PR gE抗體的間接ELISA。一種是利用大腸埃希菌表達gE基因N末端氨基酸1位～125位的融合蛋白而建立的重組gE-ELISA，一種是利用親和層析技術從病毒粒子中提純的天然gE蛋白而建立的親和層析gE-ELISA。這兩種ELISA法均可區分gE基因缺失苗免疫與野毒感染所產生的抗體。美國和歐共體規定，使用的疫苗至少要缺失gE基因，利用gE-ELISA 就可將疫苗株和野毒株區分開，從而逐步根除PR。
此外，Cook等(1990)建立了檢測抗gG 抗體的阻斷gG-ELISA，該方法可以區分疫苗株與野毒株，但敏感性不如常規ELISA法[19]。有研究發現在有母源抗體存在的情況下，gG缺失株疫苗免疫原性好于gE缺失株。唐勇等也建立了gC-ELISA鑒別診斷方法，并成功的制成了試劑盒[20]。
ELISA方法敏感性高、特異性強，而且簡便、快速、重復性好，適于大量樣品的檢測，是目前最好的鑒別診斷方法。但要注意根據不同地區或豬場所使用的基因缺失疫苗關聯的ELISA法，以免造成誤診。
Scherba G等(1992)在根據gG基因和lacz基因設計了上下游引物，建立了區分PRV疫苗株與野毒株的PCR方法，并通過對PCR產物進行Southern雜交和液相色譜分析建立了定量PCR技術。Hasebe H等(1993)根據gD和gE-g I基因序列設計兩對引物，對人工感染Bartha、BUK以及另外5株野毒的豬組織DNA進行擴增，也能有效地區分強弱毒。冉智光(1998)等分別根據gB和gE設計兩對引物建立了復合PCR鑒別診斷方法，成功的將國內普遍防疫使用的Bartha-K61株和野毒株區分開。劉莉娜等[21]建立了多重PCR，檢出了106 pg的基因缺失苗毒且特異性好。陳陸等[22]建立了gE/gB鑒別診斷方法，敏感、特異且可以檢測潛伏感染。
應用電子顯微鏡可以直接觀察PRV粒子。王家富等(1996) 在電鏡下觀察純化的PRV湖北株，發現結構與皰疹病毒極為相似，成熟的病毒顆粒呈球形或圓形，直徑在200 nm，囊膜較厚，病毒外周可看到纖突，也可以看到直徑約150 nm的小囊膜病毒、未成熟病毒粒子。
目前，可以用來診斷豬PRV的多種檢測手段中，傳統檢測手段可靠，但往往操作較復雜，或耗時較長，實際應用有一定困難。血清學檢測手段，尤其是研制成功的LAT和部分ELISA試劑盒操作簡單、方便，不需要使用昂貴復雜的儀器，已經被廣泛應用，特別是鑒別ELISA試劑盒可鑒別野毒感染和疫苗免疫動物，但一些ELISA方法還不夠完善仍，是有待解決的問題。分子生物學方法特別是PCR技術，隨著研究的深入將更加趨于敏感、簡便、快速、實用化。目前，美國和歐盟國家已經啟動了PR撲滅計劃。建立和完善可用于我國PR的控制以致最終消滅該病的診斷方法，是我國廣大獸醫科技工作者面臨的重大課題之一。
作者: daijixin1 時間: 2007-7-13 10:45
太專業了！呵呵！:qinang:
作者: syz 時間: 2007-7-13 16:05
!3: !3: 感謝樓主發的資料.
作者: xiazai 時間: 2007-7-30 11:28
太專業了！呵呵！ 不明白呀
作者: zhangmc 時間: 2007-8-11 16:53
專業性太強，仔細研究一下
作者: lyczhn1 時間: 2007-12-27 10:30
現在實驗室金標也常用!
作者: jku002 時間: 2007-12-29 09:02
學習學習，不過只看懂一點，呵呵
作者: 趕海人 時間: 2008-1-2 19:59
樓主真強，想請教樓主哪種偽狂犬疫苗較好？
作者: !中國畜牧人! 時間: 2008-2-29 22:14
:xuehu: 學習 學習:qinang:
作者: kdm6000 時間: 2008-3-4 21:23
太專業啦，我只想知道臨床和剖檢病理變化就行了:tiaotiao:
作者: 張文豪 時間: 2008-5-8 15:29
很好的資料!很好的資料!很好的資料!
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